Erinevus lehekülje "Transformatsioon (geneetika)" redaktsioonide vahel

keeletoimetus
P (pisitoimetamine)
(keeletoimetus)
 
[[Molekulaarbioloogia]]s mõistetakse '''transformatsiooniTransformatsioon''' allon muutus [[Rakk|raku]] geneetilist muutumist[[Genoom|genoomis]], mis juhtub vaba, valkude poolt sidumata eksogeense [[DNA]] sattumisest väliskeskkonnast läbi [[rakumembraan]]i [[rakk]]urakku, kus see raku enda geneetilise materjaliga liidetakse ningja võõrgeeni [[Geeniekspressioon|ekspresseeritakse]]. Transformatsiooni tulebesineb etteosal niibakteriliikidest mõnedelooduslikult, bakteriliikidekuid puhulseda looduses kuikasutatakse ka sihipäraselaboratoorselt tegutsemiseerinevate tulemusenamolekulaarsete laboristehnikate käigus. Transformatsioon on üks kolmest protsessist, mille käigusabil on[[Bakterid|bakterirakud]] võimalikgeneetilist võõr-DNA-d bakterirakkumaterjali viiavahetavad. Teisteks võimalusteks on [[konjugatsioon]], mis ilmnebesineb kahe bakteri otsesel kokkupuutel, ja [[transduktsioon]], kus eksogeenne materjal viiakse bakterirakku [[bakteriofaag]]i abil. Baktereid, kes on võimelised transformeeruma, nimetatakse kompetentideks. Ka teisi rakke peale bakterite on võimalik transformeerida, näiteks [[Taimerakk|taime]]- ja [[Loomarakk|loomarakke]], kuid eelistatum mõiste kirjeldamaks võõr-võõra DNA viimist eukarüootsesse rakku on [[transfektsioon]]. Loomarakkude puhul välditakse antudselle protsessi puhul transformatsiooni mõiste kasutamist, sest "malignant transformation" ehk pahaloomuline[[Maliigne transformatsioon|maliigse tähendabtransformatsiooni]] ühtlasiall mõistetakse ka normaalsete rakkude muutumist pahaloomulisteks kasvajarakkudeks, millel pole seost rakuvälise geneetilise materjali sattumisega rakku.<ref name="oYDYU" />
{{keeletoimeta}}
[[Molekulaarbioloogia]]s mõistetakse '''transformatsiooni''' all raku geneetilist muutumist, mis juhtub vaba, valkude poolt sidumata eksogeense [[DNA]] sattumisest väliskeskkonnast läbi [[rakumembraan]]i [[rakk]]u, kus see raku enda geneetilise materjaliga liidetakse ning võõrgeeni ekspresseeritakse. Transformatsiooni tuleb ette nii mõnede bakteriliikide puhul looduses kui ka sihipärase tegutsemise tulemusena laboris. Transformatsioon on üks kolmest protsessist, mille käigus on võimalik võõr-DNA-d bakterirakku viia. Teisteks võimalusteks on [[konjugatsioon]], mis ilmneb kahe bakteri otsesel kokkupuutel, ja [[transduktsioon]], kus eksogeenne materjal viiakse bakterirakku [[bakteriofaag]]i abil. Baktereid, kes on võimelised transformeeruma, nimetatakse kompetentideks. Ka teisi rakke peale bakterite on võimalik transformeerida, näiteks taime- ja loomarakke, kuid eelistatum mõiste kirjeldamaks võõr-DNA viimist eukarüootsesse rakku on [[transfektsioon]]. Loomarakkude puhul välditakse antud protsessi puhul transformatsiooni mõiste kasutamist, sest "malignant transformation" ehk pahaloomuline transformatsioon tähendab ühtlasi ka normaalsete rakkude muutumist pahaloomulisteks kasvajarakkudeks, millel pole seost rakuvälise geneetilise materjali sattumisega rakku.<ref name="oYDYU" />
 
==Ajalugu==
Esmakordselt demonstreeris transformatsiooni toimumist aastal 1928 briti bakterioloog [[Frederick Griffith]], kes tegelesuuris kahekaht ''[[Streptococcus pneumoniae]]'' tüve uurimisega. Kui Griffith süstis hiiri ohutu tüve (II-R) bakterite või kuumusega tapetud haigust tekitava tüve (III-S) bakteritega, jäid hiired ellu, kuid nende kahe kombinatsioon osutus hiirtele surmavaks. Surnud hiirte verest õnnestus tal isoleerida mõlema tüve elusaid rakke ning järeldas sellest, et mingi seaduspära järgi on võimalik ühe bakteritüve muundumine teiseks. Tema mõtet arendasid edasi [[Oswald Avery]], [[Colin MacLeod]] ja [[Maclyn McCarty]], kes tõestasid aastal 1944, et tegu on geneetilise materjali ülekandega. Kasutades samu tüvesid, isoleerisid nad [[virulentsus|virulentse]] tüve DNA ja näitasid, et selle viimisest II-R tüvesse piisab, et kahjutu tüvi samuti virulentseks muutuks, kummutades sellega tol ajal laialt levinud arusaama, et [[valk|valgud]] on pärilikkust kandvaks materjaliks. DNA hõivamisthaaramist väliskeskkonnast rakku ja selle arvamist raku enese DNA hulka hakkasid nad nimetama transformatsiooniks. Algul suhtuti nende avastusse küll suure umbusuga, kuid geneetiliste markerite kasutuselevõtt ja teiste geneetilise materjali ülekandemeetodite avastamine [[Joshua Lederberg]]i pooltavastused teiste geneetilise materjali ülekandeviiside osas<ref name="e5qmL" /> (konjugatsioon 1947. ja transduktsioon 1953. aastal) veenisveensid teaduskogukonda Avery tulemusi tunnustama.
Siiski oldi üsna veendunud, et ''[[Escherichia coli]]'' ei ole transformatsioonialdis. Alles aastal 1970 näitasid [[Morton Mandel]] ja [[Akiko Higa]],<ref name="vP5SH" /> et [[kaltsiumkloriid]]i lahusega töötlemise tagajärjel on ''E. coli'' võimeline väliskeskkonnast ilma faagi abita bakteriofaagi DNA-d inkorporeerima. Paar aastat hiljem tõestasid Stanley Cohen, Annie Chang ja Leslie Hsu,<ref name="LzP4l" /> et sarnane meetod on efektiivne ka [[plasmiid]]se DNA puhul. Mandeli ja Higa meetodit arendas hiljem edasi [[Douglas Hanahan]].<ref name="CpFJs" /> Kunstlikult tekitatud kompetentsuse võimalikkuskompetentsus ''E. coli'' kui laialdaselt kasutatava [[mudelorganism]]i puhul pani aluse mugava ja efektiivse metoodika arendamisele bakterite transformeerimiseks, mis võimaldab [[biotehnoloogia]]s ja teadustöös kasutada varasemast oluliselt lihtsamaid molekulaarse [[kloneerimineMolekulaarne kloonimine|kloneerimisemolekulaarse kloonimise]] võtteid. Praeguseks on transformatsiooni näol tegu igapäevase laboriprotseduuriga.
Transformatsioon [[elektroporatsioon]]i teel arendati välja 1980. aastate lõpul, tuues kaasaparandades ''[[in- vitro]]'' transformatsiooni efektiivsuse tõusuefektiivsust ja võimalusetekitades võimalusi enamate bakteritüvede transformatsiooniks.<ref name="LdLsW" /> Uuriti ka taime- ja loomarakkude transformeerimise võimalusi, mis päädis esimese [[transgeenne|transgeense]] hiire loomisega aastal 1982, süstides hiire [[embrüo]]sse geeni roti [[Kasvuhormoon|kasvuhormooni]] jaoks.<ref name="ruJCf" /> Varajastel 1970. aastatelaastate alguses avastati, et Ti-plasmiid ''[[Agrobacterium tumefaciens]]''′i rakkudes on põhjuseks, miks antud bakter taimedele kasvajaid tekitab.<ref name="CRTnO" /> [[Ti-plasmiid]] integreerub taime [[genoom]]i,<ref name="s98pO" /> kutsudes esile tuumorite teket. Asendades Ti-plasmiidis kasvajat tekitava geeni mõne muu huvipakkuva [[geen]]iga, on võimalik ''A. tumefaciens''’iga taimi nakatades viia [[kaheiduleheline|kaheiduleheliste]] taimede genoomi viia valitud DNA. [[Üheiduleheline|Üheiduleheliste]] ja mõningate teiste ''A. tumefaciens''’i suhtes tundetuteresistentsete taimede transformatsiooniks kasutatakse elektroporeerimist ning [[mikro-injektsioonMikroinjektsioon|mikroinjektsiooni]]i.<ref name="fdfJg" /> [[Biolistiline|Biolistilise]] meetodi ehk raku pommitamise geneetilise materjaliga kaetud metalliioonidega võttis 1990. aastal kasutusele [[John Stanford]].<ref name="4ypbk" />
 
==Mehhanismid==
===Bakterid===
 
Bakterite puhul mõistetakse transformatsiooni all püsivat muutust raku genoomis, mida on toonud kaasa vaba DNA hõivaminehaaramine väliskeskkonnast rakku ja kompetentsuse all peetakse silmas võimet vaba DNA-d rakuvälisest keskkonnast rakku võtta. Kompetentsus võib esineda nii looduslikult kui tekkida kunstlikult.
all peetakse silmas võimet vaba DNA-d rakuvälisest keskkonnast rakku võtta. Kompetentsus võib olla nii loomulik kui kunstlik.
 
====Looduslik kompetentsus====
Umbes 1% bakteriliikidest on loomulikult kompetentsed, olles võimelised laborikeskkonnas ilma lisatöötluseta vaba DNA-d oma rakku võtma. On alust arvata, et looduslikus keskkonnas on see protsent suurem. DNA kandumist ühelt bakterilt teisele nimetatakse [[horisontaalne geeniülekanne|horisontaalseks geeniülekandeks]], mis onehk geneetilise materjali saaminesaamiseks teiselt organismilt, olemata selle järglane.<ref name="u6fOD" /> Lähedaste liikide vahel toimib transformatsioon paremini kui evolutsiooniliselt kaugemate liikide puhul. Looduslikult kompetentsetes bakterites on olemas geenikomplektid, mis kodeerivad DNA transmembraanseks transpordiks vajalikke valke, näiteks [[DNA translokaas]]i komplekse tsütoplasmamembraanis <ref name="iFHvZ" /> ja tüüp IV kiudude[[Piil|piilide]] kokkupanekuks tarvilikke valke.
Umbes 1% bakteriliikidest on loomulikult kompetentsed, olles võimelised laborikeskkonnas ilma lisatöötluseta vaba DNA-d oma rakku võtma.
On alust arvata, et looduslikus keskkonnas on see protsent suurem. Kui DNA kandub üle ühelt bakteritüvelt teisele, nimetatakse seda
[[horisontaalne geeniülekanne|horisontaalseks geeniülekandeks]], mis on geneetilise materjali saamine teiselt organismilt, olemata selle järglane.<ref name="u6fOD" /> Lähedaste liikide vahel toimib transformatsioon paremini kui evolutsiooniliselt kaugemate liikide puhul. Looduslikult kompetentsetes bakterites on olemas geenikomplektid, mis kodeerivad DNA transmembraanseks transpordiks vajalikke valke, näiteks [[DNA translokaas]]i komplekse tsütoplasmamembraanis <ref name="iFHvZ" /> ja tüüp IV kiudude kokkupanekuks tarvilikke valke.
 
Tulenevalt [[Grampositiivsed bakterid|grampositiivsete]] ja [[Gramnegatiivsed bakterid|gramnegatiivsete]] bakterite rakumembraani erinevustest esineb mõningaid erinevusi viisis, kuidas täpselt bakterid rakuvälist DNA-dgeneetilist materjali enda sisse toovad, kuid üldjoontes on protsess siiski sarnane. Esmalt seondub DNA kompetentse raku pinnal paiknevale DNA -retseptorile ningja liigub DNA translokaasi abil läbi rakumembraani.<ref name="ygXFd" /> Selle käigus lagundatakse selle üks ahel [[Nukleaas|nukleaaside]] poolt, kuna rakku pääseb vaid üheahelaline DNA. Sellist üheahelalist DNA-d on RecA ehk [[rekombinaas A]] abil võimalik genoomi integreerida. Gramnegatiivsed bakterid vajavad oma rakukestarakuseina mitmekihilise ehituse tõttu valgulist kanalit ka välisesse membraanivälismembraanis, mille moodustavad [[sekretiinid]]. Arvatakse ka, et oma roll on [[piliin]]il, kuid selle funktsiooni kohta pole veel kuigi palju teada.<ref name="MBO2f" /> DNA transport rakku poleei sõltu enamasti järjestuse-spetsiifilineselle järjestusest, ent mõnedemõne liigi puhul võivad kindlad järjestused rakuvälises DNA-s seda soodustada.<ref name="3duKe" />
liikide puhul võivad kindlad järjestused rakuvälises DNA-s seda kergendada.<ref name="3duKe" />
 
====Kunstlik kompetentsus====
Kunstliku kompetentsuse tekitamiseks on kaks enamlevinud meetodit: elektroporatsioon ja rakkude manipuleerimine temperatuuri ning soolalahuse abil. Mõlemad neist muudavad rakuseinarakumembraani DNA-le passiivselt läbitavaks looduses harilikult mitteilmnevate keskkonnategurite mõjul.<ref name="1cp9s" />
Elektroporatsiooni käigus antakse bakterirakkudebakterirakke sisaldavale lahusele, kuhu on lisatud soovitav plasmiid, elektrilöök, mis perforeerib nende rakuseinarakumembraani, et plasmiidne DNA siseneda saaks. PealePärast elektriväljale eksponeerimisteksponeerumist parandavad rakubakteri membraaniparandusmehhanismidkaitsemehhanismid augudrakumembraani taasdefektid väledastitaas ära. Tegu on rakusõbralikuma meetodiga kui soolalahuse kasutamine, kuna rakud viibivad stressitekitavateskahjustavates tingimustes palju lühemat aega. Kasutatava elektrivälja tugevus jääb tavaliselt vahemikku 10–20 kV/cm.
Keemilisi kompetente hoitakse mõnda aega jää peal kahevalentsete [[Katioon|katioonidega]] soolalahuses, enamasti on selleks [[Kaltsiumkloriid|kaltsiumkloriidi]] lahuslahuses, misjärel vapustatakse neid kiire lühiajalise kuumutamisega. Arvatakse, et soolalahuse positiivsed [[ioon]]id aitavad bakterikestabakteriraku negatiivseltnegatiivse laetudlaenguga pinnamolekule neutraliseerida, muutmaksmuutes membraani negatiivselt laetud DNA jaoks paremini läbitavaks. Kuumašokk on vajalik selleks, et tekitada temperatuurierinevus raku sise- ja väliskeskkonnas, mis sunnib DNA läbi kahjustatud membraani rakku sisenema.
===Taimed===
 
DNA viimiseks taimedesse on mitmeid mehhanisme. Lihtsaim neist on transformatsioon ''Agrobacterium tumefaciens''’i abil. Selleks lõigatakse taime kudetaimekude, milleks tavaliselt on [[leht]], väikesteks tükkideks ja leotatakse umbes kümme minutit ''Agrobacterium''’i sisaldavas [[suspensioon]]is. ServmisedLõikepindade servmised rakud, mis asuvad lõikepinnal, saavadtransformeeruvad bakteri poolt transformeeritud.mõjul Kui selliselt töödeldud koetükid juurdumise ja võrsekasvu suhtes selektiivsel söötmel üles kasvatada, saadakse geneetiliselt teisenenudmodifitseeritud taimed. Mõnede taimeliikide puhul piisab ka sellest, kui nende [[õis]] bakterisuspensiooni kasta ja hiljem [[Seeme|seemned]] selektiivsele söötmele külvata. Paljusid taimeliike antudselle meetodiga siiski modifitseerida ei saa. Väga suurSuur osa taimedestaimedest on transformeeritavad [[Kuld|kulla]]- või volframiosakestega[[Volfram|volframi]]<nowiki/>osakestega pommitamise teel. Selleks kaetakse metalliosakesed DNA-ga ning tulistatakse noortesse taimerakkudesse või taimeembrüosse. Efektiivsus on sel meetodil küll madalam kui ''Agrobacterium''’i kasutades, kuid võimalikesobivate mõjustatavate taimedetaimeliikide valik on oluliselt laiem. Samuti on suureks eeliseks see, et nii saab transformeerida ka taime [[Plastiidid|plastiide]]. Kolmandaks võimaluseks on taimerakkude elektroporatsioon, mis toimib sarnaselt bakterite puhul kirjeldatule.
DNA viimiseks taimedesse on mitmeid mehhanisme.
Lihtsaim neist on transformatsioon ''Agrobacterium tumefaciens''’i abil. Selleks lõigatakse taime kude, milleks tavaliselt on [[leht]], väikesteks tükkideks ja leotatakse umbes kümme minutit ''Agrobacterium''’i sisaldavas [[suspensioon]]is. Servmised rakud, mis asuvad lõikepinnal, saavad bakteri poolt transformeeritud. Kui selliselt töödeldud koetükid juurdumise ja võrsekasvu suhtes selektiivsel söötmel üles kasvatada, saadakse geneetiliselt teisenenud taimed. Mõnede taimeliikide puhul piisab ka sellest, kui nende õis bakterisuspensiooni kasta ja hiljem seemned selektiivsele söötmele külvata. Paljusid taimeliike antud meetodiga siiski modifitseerida ei saa. Väga suur osa taimedes on transformeeritavad kulla- või volframiosakestega pommitamise teel. Selleks kaetakse metalliosakesed DNA-ga ning tulistatakse noortesse taimerakkudesse või taimeembrüosse. Efektiivsus on sel meetodil küll madalam kui ''Agrobacterium''’i kasutades, kuid võimalike mõjustatavate taimede valik on oluliselt laiem. Samuti on suureks eeliseks see, et nii saab transformeerida ka taime plastiide. Kolmandaks võimaluseks on taimerakkude elektroporatsioon, mis toimib sarnaselt bakterite puhul kirjeldatule.
 
Geneetilist materjali on võimalik taimerakkudesse viia ka mitmete [[viirus|taimeviiruste]] abil, kuid seesiis pole transformatsioontegemist transformatsiooni, vaid [[transduktsioon|transduktsiooniga]] – rakku viidav info on pakitud viiruskapslisse. Kuna suurem osa taimeviirustest on ssRNA-viirused, kelle pärilik materjal tsütoplasmas replitseerub [[Tsütoplasma|tsütoplasmas]], siis enamasti saab sel moel mõjustadaenamasti modifitseerida vaid üht põlvkonda rakke. Nakatatud taime järglased ei ole viirusega nakatunud ega kanna endas sisestatud geeni. DNA-viirused seevastu on võimelised [[Kromosoom|kromosoomidega]] [[Homoloogiline rekombinatsioon|rekombineeruma]], tekitades taime genoomis püsivaid muutusi, mistõttu kandub sellinemis ümberkorralduskanduvad üle ka järglastele.
 
===Loomad===
 
DNA viimist loomsetesse rakkudesse nimetatakse harilikult [[transfektsioon]]iks. Ka sel puhul muudetakse rakusein erinevate võtete abil auklikukspoorseks, et soovitud materjal rakku liikuda saaks. Transfektsioon ei tähenda ainult DNA viimist rakku, selleksvaid võib olla näitekska siRNA konstruktkonstruktsiooni või valkvalgu (näiteks antikeha) rakku sisestamist. Transfekteerimiseks kasutatakse [[Kaltsiumfosfaat|kaltsiumfosfaati]], elektroporatsiooni või segatakse rakku viidav aine katioonsete [[Lipiidid|lipiididega]], moodustamaks [[liposoom]]e, mis membraaniga kokku suladesühinedes sisaldise rakku viivad.
 
==Praktilisi külgiRakendusi molekulaarbioloogias==
 
Kunstliku kompetentsuse tekitamine bakterites võimaldab DNA-ga ja valkude ekspressiooniga manipuleerida. Levinuimaks mudelorganismiks on ''Escherichia coli'', kedamida enamasti plasmiididega transformeeritakse. Plasmiidsel DNA-l peab rakku püsimajäämiseks olema oma [[replikatsiooni alguspunkt]], et tedaseda genoomist sõltumatult paljundada saaks. TransformatsiooniefektiivsuseTransformatsiooni efektiivsuse ehk tõhususe, millega töödeldud bakterid väliskeskkonnast DNA-d üles korjavadomastavad, mõõtühikuks on [[CFU]]/μg DNA kohta.
Kunstliku kompetentsuse tekitamine bakterites annab hea võimaluse DNA-ga manipuleerimiseks ja valkude ekspressiooniks. Levinuimaks
mudelorganismiks on ''Escherichia coli'', keda enamasti plasmiididega transformeeritakse. Plasmiidsel DNA-l peab rakku püsimajäämiseks olema oma [[replikatsiooni alguspunkt]], et teda genoomist sõltumatult paljundada saaks. Transformatsiooniefektiivsuse ehk tõhususe, millega töödeldud bakterid väliskeskkonnast DNA-d üles korjavad, mõõtühikuks on CFU/μg DNA kohta.
 
[[CFU]] ehk ''colony forming unit'' väljendab eluvõimeliste rakkude hulka näitesmingis milliliitriskoguses lahuses. Väikese plasmiidi, nagu pUC19, puhul tähendab transformatsiooniefektiivsus 1×10<sup>8</sup> cfuCFU/μg seda, et umbes 1üks plasmiid 2000 hulgast lähebsiseneb rakku. sisseKeemiliste kompetentide puhul hoitakse rakke jää peal külmas CaCl<sub>2</sub> lahuses, muutes rakud plasmiidsele DNA-le läbitavaks. Rakke inkubeeritakse jääl plasmiidi juuresolekul ja seejärel kuumutatakse 42&nbsp;°C juures sõltuvalt metoodikast 30–120 sekundit. Mittetööstuslikud meetodid annavad tulemuseks keskmiselt 10<sup>6</sup>–10<sup>7</sup> transformanti mikrogrammi plasmiidi kohta. Keemiline meetod toimib plasmiidse DNA puhul väga hästi, kuid ei sobi lineaarsete DNA-fragmentide puhul, arvatavasti seetõttu, et raku eksonukleaasid lagundavad lineaarse DNA kiiresti ära. Looduslikud kompetendid seevastu transformeeruvad lineaarse DNA-ga paremini kui plasmiidsega.
Keemiliste kompetentide puhul hoitakse rakke jää peal külmas CaCl<sub>2</sub> lahuses, muutes rakud plasmiidsele DNA-le läbitavaks. Rakke inkubeeritakse jääl plasmiidi juuresolekul ja seejärel kuumutatakse 42&nbsp;°C juures sõltuvalt metoodikast 30–120 sekundit. Mittetööstuslikud meetodid annavad tulemuseks
keskmiselt 10<sup>6</sup>–10<sup>7</sup> transformanti mikrogrammi plasmiidi kohta. Keemiline meetod toimib rõngasja DNA puhul väga hästi, kuid ei kõlba lineaarsete DNA fragmentide tarvis, arvatavasti seetõttu, et raku eksonukleaasid lagundavad lineaarse DNA kiiresti ära. Looduslikud kompetendid seevastu transformeeruvad lineaarse DNA-ga paremini kui plasmiidsega.
 
Transformatsiooni efektiivsus väheneb plasmiidi suuruse kasvades, mistõttu kasutatakse suuremate DNA -molekulide puhul elektroporatsiooni.<ref name="e196P" /> Elektroporeeritavaid rakke on enne töötlust soovitatav pesta külma mitmekordselt [[Destilleeritud vesi|destilleeritud veega]], eemaldamaks laetud osakesi, mis protsessi käigus sädet anda võiksid.
 
==Vaata ka==
<ref name="e196P">[Transformation efficiency of "'E. coli'" electroporated with large plasmid DNA. Focus 20:3 (1998)].</ref>
}}
{{viited|allikad=
 
}}
 
[[Kategooria:Molekulaarbioloogia]]
[[Kategooria:Geneetika]]
515

muudatust