Redaktsioon: 5. detsember 2017, kell 20:17 redigeeri Ivarik (arutelu \| kaastöö) 135 muudatust PResümee puudub Märgis: Visuaalmuudatus ← Vanem muudatus		Redaktsioon: 5. detsember 2017, kell 20:20 redigeeri eemalda Ivarik (arutelu \| kaastöö) 135 muudatust PResümee puudub Märgis: Visuaalmuudatus Uuem muudatus →
12. rida: == Fikseerimine == Fikseerimine on immunofluorestsentsi protokolli kõige esimene etapp. Fikseerimise eesmärgiks on säilitada rakke, rakulisi moodustisi või [[kude]]t oma hetkelises seisukorras. Fikseerimise juures on oluline see, et rakulised struktuurid jääksid oma natiivsesse vormi nii kauaks kui võimalik. Immunofluorestsentsil kasutatakse mitmeid erinevaid fikseerimise meetodeid ning need võivad primaarse antikeha [[epitoop\|epitoobile]] erinevalt mõjuda. Antikeha seondumiskohad võivad fikseerimise tagajärjel maskeeruda või kahjustuda ning see nõrgendab immunofluorestsentsi kvaliteeti. Kuna paljud antikehad seonduvad fikseerimisühenditest sõltuvalt erinevalt oma antigeeniga, siis on uue antikeha kasutamisel vaja testida mitmeid erinevaid fikseerimismeetodeid. Fikseerimisreagente saab jaotada kaheks: keemilised ristsidujad ja orgaanilised lahustid. Keemilised ristsidujad nagu näiteks [[formaldehüüd]] ristseovad valke nende vabade [[funktsionaalrühm\|aminorühmade]] kaudu. Enamasti raku [[morfoloogia]] seejuures säilitatakse, kuid antigeenid ristseotakse samuti ning see võib vähendada antikeha seondumist. Orgaanilised lahustid nagu näiteks [[metanool]] ja [[atsetoon]] on vett eemaldava toimega ja sadestavad valkusid, ~~seetõttu~~ning ~~fikseerides~~on seetõttu ~~neid~~rakke ~~rakulises~~fikseeriva ~~kontekstis~~toimega. Sellise fikseerimise puhul aga kaotatakse palju rakus leiduvaid lahustuvaid ühendeid ning [[lipiid]]seid komponente. Tihti kasutatakse metanooli ja atsetooni koos, sest kuigi metanool on parim vahend rakuliste struktuuride säilitamiseks, on tal kahjustav efekt paljudele epitoopidele. Kui primaarse antikeha tootja pole ühtegi fikseerimise meetodit soovitanud, siis enamikule [[rakuliin]]idele ja antigeenidele sobib 4% formaldehüüdi lahus 10 minuti jooksul toatemperatuuril. <ref name="Florian Hoff"/> == Permeabiliseerimine == Permeabiliseerimise käigus tehakse [[rakumembraan]]i augud (kuid ei eemalda kogu rakumembraani) ning see aitab antikehadel pääseda fikseeritud rakkudesse, sest tavaolukorras ei suuda antikehad membraani läbida. Kui rakke fikseerida orgaaniliste lahustitega, siis rakumembraanid muutuvad läbitavaks ning eraldi permeabiliseerimise protseduuri pole tarvis läbi viia. Keemiliste ristsidujatega fikseerides on aga permeabiliseerimine vajalik. Permeabiliseerimiseks kasutatakse mitmeid [[detergent]]e, nagu näiteks [[NP-40]], [[Triton X-100]], [[Tween-20]] ja [[saponiin]]. Raku pinnal asuvaid valke uurides pole permeabiliseerimine vajalik. Fikseerimine ja permeabiliseerimine mõjutavad raku morfoloogiat ja uuritava antigeeni kättesaadavust. <ref>[https://microscopy.duke.edu/guides/intro-sample-prep-immunofluorescence Introduction to Sample preparation: Immunofluorescence] Duke University koduleht (vaadatud 27.10.2017)</ref>

Kasutaja:Ivarik/Immunofluorestsents: erinevus redaktsioonide vahel