Kasutaja:Kj19/Dna kloneerimine: erinevus redaktsioonide vahel

Kloonimisvektorit töödeldakse restriktaasidega, et lõigata DNA-d saidist, kuhu sisestatakse võõr-DNA. Restriktaas, millega lõigata, valitakse nii, et lõikuse tulemusena tekkivad "kleepuvad otsad" sobiksid sisestatava võõr-DNA "kleepuvate otstega". Tavaliselt saavutatakse vajalik tulemus, kui lõigatakse nii vektorit kui ka sisestatavat DNA-d samade restriktaasidega nt. EcoR1-ga. Enamik tänapäevastest vektoritest sisaldavad mitmeid erinevaid unikaalseid restriktsioonisaite. Samas on iga sait esindatud ühe korra, et vältida vektori ribadeks lõikamist. Tavaliselt asuvad restriktsioonisaidid mingi [[geen]]i sees (sagedasti &beta;-galaktosidaasi geen), mille inaktivatsiooni alusel saab vahet teha rekombinantsetel ja mitterekombinantsetel organismidel hilisemates etappides. Selleks, et suurendada rekombinantide tekke sagedust, töödeldakse lõigatud vektorit aluseliste fosfataasidega, mis defosforüülivad vektori lahtised otsad. Defosforüülitud otstega vektor ei ole võimeline [[replikatsioon|replitseeruma]] ja selle võime saab taastada ainult siis, kui vektorisse integreerub kloonitav DNA.<ref name="isbn0-87969-576-5">{{cite book |author=Russell, David W.; Sambrook, Joseph |title=Molecular cloning: a laboratory manual |publisher=Cold Spring Harbor Laboratory |location=Cold Spring Harbor, N.Y |year=2001 |pages= |isbn=0-87969-576-5 |oclc= |doi= |accessdate=}}</ref>

Kui mikroorganismid on võimelised ümbritsevast keskkonnast endasse võtma ja replitseerima võõr-DNA järjestusi, siis nimetatakse seda protsessi [[transformatsioon (geneetika)|transformatsiooniks]] ja selliseid rakke kompetentseteks<ref name="pmid8150273">{{cite journal |author=Lederberg J |title=The transformation of genetics by DNA: an anniversary celebration of Avery, MacLeod and McCarty (1944) |journal=Genetics |volume=136 |issue=2 |pages=423–6 |year=1994 |month=February |pmid=8150273 |pmc=1205797 |doi= |url=}}</ref> rakkudeks. Vähesed bakteriliigid on looduslikult kompetentsed. Suuremat osa neist tuleb enne kemikaalidega töödelda ja kasvatada kindlal režiimil (õige toitainete segu jne). KompetenseteKompetentsete rakkude saamiseks vajalikud protsessid varieeruvad liigiti ja rakutüübiti.

[[Transduktsioon]]i puhul sisestatakse võõr-DNA viiruse partiklisse ([[bakteriofaag]]i), mille genoomist on eemaldatud patogeensust põhjustav genetilinegeneetiline materjal ja mis on bakteritele ohutu, ning siis nakatatakse rakke nende partiklitega. Toimub viiruse infektsioon ja DNA vabastatakse rakku. Tavaliselt on transduktsioon ja elektroporatsioon kõige efektiivsemad mehhanismid DNA sisestamiseks peremeesorganismi.

Olenemata millist meetodit kasutatakse, on võõr-DNA rakku sisenemine väikese effektiivsusegaefektiivsusega. Ainult väike osa rakkudest võtab võõr-DNA oma koosseisu. Teadlased on selle probleemi lahendanud markergeenidega. Rakud, mis ei ole sisestatud järjestust omaks võtnud, tapetakse selektiivselt.<ref name="isbn1-4051-1121-6" /><ref name="isbn0-87969-576-5" /> Kui peremeesorganismina kasutatakse baktereid, siis markergeeniks on tavaliselt mõne [[antibiootikumid|antibiootikumi]] resistentsusgeen. Tavaliseks antibootikumiksantibiootikumiks on ampitsiliinampitsilliin. Transduktsiooni/transformatsiooni/elektroporatsiooni läbinud rakud külvatakse Petri tassidele, mis sisaldavad lisaks kasvamiseks vajalikele toitainetele ka ampitsiliiniampitsilliini. Bakterid, mis ei ole endasse võtnud võõr-DNA-d, ei sisalda [[antibiootikumresistentsus|antibiootikumi resistentsusgeeni]] ja surevad. Kolooniad, mis jäävad ellu, sisaldavad sisestatud DNA-d, sest vektoris sisaldub lisaks sisestatud järjestusele ka antibiootikumi resistentsusgeen.

Tänapäevaste vektorite puhul kasutatakse rekombinantide eristamiseks rakkudest, mis on endasse võtnud algse, ilma ''inserdita'' vektori, sini-valge testi. Nende vektorite puhul sisestatakse kloonitav DNA järejstusejärjestuse vahele, mis kodeerib &beta;-galaktosidaasi olulist osa. &beta;-galaktosidaas on ensüüm, mille aktiivsus väljendub siniste kolooniate tekkega bakterikultuuris. (&beta;-galaktosidaas on hüdrolaasi ensüüm, mis katalüüsib &beta;-galaktoosi [[hüdrolüüs]]i [[monosahhariidid]]eks). Rakkudel, mis on omaks võtnud rekombinantse DNA, on see geen rikutud ja &beta;-galaktosidaasi aktiivsus on kadunud. Sellised rakud ei värvu siniseks ja kolooniad jäävad valget värvi. Järgnevalt on võimalik kergesti eristada ja põhjalikumalt uurida kolooniad, mis sisaldavad soovitud rekombinantset DNA-d kolooniatest, mis sisaldavad algset, tühja vektorit.