Vikipeedia

Koekiip

Koekiip (inglise keeles tissue microarray) on parafiiniplokk, kuhu on sisestatud kuni 1000 üksikut koeproovi, võimaldades samaaegselt teha histoloogilisi analüüse suure hulga kudedega. Koekiibitehnoloogiat kasutatakse kõige rohkem vähiuuringutes, kuid ka paljudes teistes teadusuuringutes.

0,6 mm läbimõõduga koeproovidest valmistatud koekiip

Ülevaade muuda

Uute tehnoloogiatega (cDNA kiibid[1], SAGE[2] jt) suudetakse korraga analüüsida paljude geenide ja valkude ekspressiooni taset. Tänu sellele saadakse suur hulk informatsiooni potentsiaalsete molekulaarsete märklaudade kohta. Raske on aga leida ja prioriseerida parimaid märklaudu kümnete tuhandete kandidaatide seast. Palju lisainfot õigete märklaudade valimiseks võimaldaks kandidaatide in situ analüüs raku tasemel, nende ekspressiooni hindamine eri kudedes ja eri haiguste korral ning nende kliinilise tähtsuse hindamine. Selleks oleks vaja läbi viia koepõhiseid molekulaarseid analüüse. Tavapäraste koepõhiste molekulaarsete analüüside probleemiks on aga see, et enamik neist on aeglased, tülikad ja vajavad ulatuslikku käsitsi sekkumist. Lisaks sellele saab ühest keskmise suurusega koeplokist lõigata vaid umbes 300 viie mikromeetrilist lõiku, seega ühe koeploki kohta saab tuvastada 300 molekulaarset märklauda, mis moodustab väga väikese osa inimese genoomis olevast 20 000 – 25 000 kodeerivast geenist ehk potentsiaalsest molekulaarsest märklauast. Seega ei ole võimalik tavapäraste koepõhiste molekulaarsete analüüsidega läbi viia ülegenoomseid uuringuid.[3] Koekiibitehnoloogia loodigi selleks, et avardada tavapäraste molekulaarse patoloogia meetodite piire.[4]

Ajalugu muuda

Hector Battifora tutvustas esimesena aastal 1986 koeplokki, mis sisaldab mitut kude, ja nimetas selle "mitme kasvaja (vorstiks) koeplokiks" (multitumor (sausage) tissue block).[5] 1990. aastal modifitseeris ta oma leiutist ning nimetas selle ümber "malelaua koeplokiks" (the checkerboard tissue block).[6]

1998. aastal töötasid Juha Kononen ja tema kaastöötajad välja praegu kasutusel oleva koekiibi tehnoloogia, mis kujutab endast uudset koeproovide käsitlemise meetodit. Koekiip on tihedalt ja täpselt ridadesse seatud ühesuguse suuruse ja kujuga silindriliste koeproovidega parafiiniplokk.[4]

Planeerimine muuda

Kõige töömahukam osa koekiibi valmistamisel on retsipient- ehk vastuvõtjaplokki sisestatavate kudede otsimine, korrastamine ja neile patoloogilise hinnangu koostamine. parafiiniseeritud koeplokki, kust proov võetakse, nimetatakse doonor- ehk andjaplokiks. Doonorkoeplokk peaks olema histoloogiliselt representatiivne ning koe paksus parafiinis soovituslikult 3–4 mm. Valmis doonorkoeplokist lõigatakse mikrotoomiga värske lõik ning see värvitakse hematoksüliini ja eosiiniga ehk tehakse H ja E värvimine (H & E stain). Saadud preparaadilt leitakse üles soovitud morfoloogiaga piirkonnad, kust proov võetakse. Koekiibi valmistamisel on võimalik kasutada ka 20–40 aastat tagasi parafiiniseeritud kudesid, juhul kui nad on fikseeritud 4% puhverdatud formaliiniga. Arhiveeritud kudedega on aga keeruline läbi viia mRNA in situ hübridisatsiooni (ISH), sest formaliiniga fikseerimisel tekivad RNA molekulides ristseosed ja RNA degradeerub.[3]

Konstrueerimine muuda

Koekiibi valmistamine koosneb kolmest järjestikusest sammust:

  1. Retsipientplokki augu tegemine
  2. Silindrilise proovi võtmine doonorkoeplokist
  3. Silindrilise doonorkoeproovi asetamine retsipientplokki [3]

Proovide võtmiseks ja augu tegemiseks kasutatakse seest õõnsat peenikest roostevabast terasest silindrit ehk augurauda (punch). Väikseim silindri diameeter on 0,6 mm ja suurim 2 mm.[4] 0,6-millimeetrise läbimõõduga koeproovid asetatakse retsipientplokki ritta näiteks 0,8-millimeetriste vahedega. Kasutades sellist paigutust, saab 45×25 mm alale mahutada 1000 koeproovi. Enamasti sisestatakse siiski ühele retsipientplokile 400–800 koeproovi. Suurema läbimõõduga proovide kasutamisel kahjustatakse rohkem doonorkoeplokki ning vähendatakse retsipientplokile mahutatavate koeproovide hulka. Näiteks 2 mm diameetriga proove mahub retsipientplokki ainult 100–150 proovi.
Ülaltoodud protsessi korratakse sadade proovide ritta seadmiseks koekiibi seadme (tissue arrayer) abil. Koekiipide valmistamise lihtsustamiseks on leiutatud automaatseade, mis seda protsessi ise läbi viib. Automaatseadme abil on võimalik samaaegselt teha mitu koekiipi, kasutades kindlat hulka doonorkoeplokke. Näiteks saab sellega luua 1000 koeproovi sisaldava koekiibi 20 korduses ning igast kiibist saab mikrotoomiga lõigata 300 lõiku. Tulemuseks oleks 6000 koekiibislaidi ja igaüks neist sisaldaks 1000 koeproovi.[3]

Lõikamine muuda

 
Koekiibi lõik mikroskoobi alusklaasil

Koeproovide analüüsimiseks lõigatakse mikrotoomiga koekiibist õhukesed, umbes 5-mikromeetrilised, lõigud ning asetatakse mikroskoobi alusklaasile. Ühest koekiibist saab lõigata kuni 300 lõiku. Koekiibi lõikude koopiate arvu saab veelgi suurendada, koostades mitmeid koekiipe, kus vastavatest doonorkoeplokkidest võetud proovid on asetatud samadesse positsioonidesse. Igale lõigule jääb koeproovist erinev tasapind, seega hea tava kohaselt värvitakse koekiibi esimene ja iga järgnev viiekümnes lõik hematoksülliini ja eosiiniga, et hinnata koe morfoloogiat ja koeproovi olemasolu lõigus.[3]

Testide tegemine ja analüüsimine muuda

Ühe koekiibi analüüsimine annab informatsiooni kuni 1000 erineva koe kohta. Tavapäraseid meetmeid kasutades on igal mikroskoobi alusklaasil vaid üks kude. Seega 1000 koe analüüsimiseks tuleks valmistada 1000 slaidi ja viia läbi 1000 värvimisreaktsiooni. Koekiibiga on võimalik kasutada kõiki samu molekulaarsete märklaudade (RNA, DNA, valgud) detektsioonimeetodeid nagu terve koelõigu puhulgi, näiteks antikehadega värvimine või in situ hübridisatsioon. Põhiliseks limiteerivaks teguriks on meetod, kuidas kude fikseeriti. Kõige sagedamini kasutatakse koekiibi lõikudes valkude antigeenide tuvastamiseks immunohistokeemilisi (IHC) (immunohistochemistry) meetodeid. Koekiibi formaadi eelised immunovärvimiste läbiviimises ja analüüsimises:

  1. Koekiibi lõike, mis sisaldavad eri kudesid (normaalse koe paneel, vähkkude, rakukultuur), saab kasutada kontrollina ravieelsete seisundite, antikehatiitrite ja detektsioonisüsteemide testimiseks ja optimeerimiseks.
  2. Asetades kontrollkoed samale alusklaasile koos uuritavate kudedega, saab paremini hinnata IHC tundlikkust ja spetsiifilisust.
  3. Paranevad katsete korratavus, läbiviimise kiirus ja tulemuste tõlgenduse usaldusväärsus.
  4. Järjestikustel koekiibilõikudel saab morfoloogia uurimiseks läbi viia hemotoksülliini ja eosiini värvimise või värvida eri antikehadega ühe ja sama märklaua suhtes. See võimaldab võrrelda eri antikehadega värvumist võimalikult sarnastes ja histoloogiliselt rangelt kontrollitud koepiirkondades.

Koekiibi lõike on võimalik analüüsida ja hinnata tavalise valgusmikroskoobiga. Seega saavad patoloogid hinnata tulemusi väga kiiresti ilma keeruliste instrumentideta. Koekiibis on igal koeproovil oma koordinaadid, mille järgi koeproovi asukoht kiibil kindlaks tehakse. Kõikidest koekiibi lõikudest saab teha pildi ja neid arvuti abil (in silico) analüüsida. Jäädvustades tulemused pildina, saab luua digitaalse pildiarhiivi. Viimase saab siduda molekulaarse ja kliinilise info andmebaasiga.[3]

Näiteid koekiibitehnoloogia rakendustest muuda

  • Koekiipe on laialdaselt kasutatud ülegenoomsete uuringute käigus leitud märklaudgeenide edasiseks täpsemaks iseloomustamiseks. Näiteks leiti cDNA mikrokiipide abil, et rinnavähi rakuliinis esineb ribosomaalse s6 kinaasi geeni üleekspressioon. Kasutades koekiipe, näidati et 9–15%-l rinnavähijuhtudest esines selle sama geeni amplifikatsioon või vastava valgu üleekspressioon. Uuring viitas ühtlasi sellele, et s6 kinaas võib olla tähtis indikaator rinnavähi prognoosimisel.[7]
  • Koekiipide abil on leitud seoseid molekulaarsete muutuste ja kasvaja konkreetse staadiumi vahel.[3] Näiteks leiti, et AR-geeni amplifikatsioon[8] ja IGFBP2 valgu üleekspressioon[9] on väga tavaline terminaalse hormoonravile allumatule eesnäärme kasvaja puhul, kuid esineb harva primaarsetel ravimata kasvajatel.[3]
  • Koekiibitehnoloogia abiga on uuritud etniliste erinevuste tähtsust vähi põhjuslikkuses. Samuti on seostatud etioloogilisi ja riskitegureid vähi molekulaarsete tunnustega.[10]
  • Kasutades koekiipe, on uuritud geeni amplifikatsioone eri kasvajate kudedes. Selleks on koostatud mitmetest erinevatest vähkkasvajate kudedest koosnev koekiip ning viidud läbi geneetiline sõelumine (screening). Selline koekiibiga tehtud geneetiline sõelumine demonstreerib koekiibi analüüsi võimekust pakkuda laiaulatuslikku molekulaarsete muutuste geneetilist sõelumist kõikide levinud kasvajate puhul.[11]

Vaata ka muuda

Viited muuda

  1. ↑ DeRisi, J.; et al. (1996). "Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer". Nat Genet. 14 (4): 457–60. PMID 8944026. {{cite journal}}: et al.-i üleliigne kasutus kohas: |author= (juhend)
  2. ↑ Velculescu, V.E.; et al. (1995). "Serial analysis of gene expression". Science. 270 (5235): 484–7. PMID 7570003. {{cite journal}}: et al.-i üleliigne kasutus kohas: |author= (juhend)
  3. ↑ 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 Kallioniemi, Olli-P.; et al. (2001). "Tissue microarray technology for high-throughput molecular profiling of cancer". Hum Mol Genet. 10 (7): 657–62. PMID 11257096.
  4. ↑ 4,0 4,1 4,2 Kononen, J. et al. (1998). "Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens". Nat Med. 4 (7): 844–7. PMID 9662379. {{cite journal}}: et al.-i üleliigne kasutus kohas: |authors= (juhend)CS1 hooldus: kasutab parameetrit autorid (link)
  5. ↑ Battifora, H. (1986). "The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing". Lab Invest. 55 (2): 244–8. PMID 3525985.
  6. ↑ Battifora, H.; et al. (1990). "The checkerboard tissue block". Lab Invest. 63 (5): 722–4. PMID 2232717. {{cite journal}}: et al.-i üleliigne kasutus kohas: |author= (juhend)
  7. ↑ Barlund, M.; et al. (2000). "Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis". J Natl Cancer Inst. 92 (15): 1252–9. PMID 10922410. {{cite journal}}: et al.-i üleliigne kasutus kohas: |author= (juhend)
  8. ↑ Bubendorf, L.; et al. (1999). "Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays". Cancer Res. 59 (6): 1388. PMID 10029066. {{cite journal}}: et al.-i üleliigne kasutus kohas: |author= (juhend)
  9. ↑ Bubendorf, L.; et al. (1999). "Hormone therapy failure in human prostate cancer: analysis by complementary DNA and tissue microarrays". J Natl Cancer Inst. 91 (20): 1758–64. PMID 10528027. {{cite journal}}: et al.-i üleliigne kasutus kohas: |author= (juhend)
  10. ↑ Perrone, E.E.; et al. (2000). "Tissue microarray assessment of prostate cancer tumor proliferation in African-American and white men". J Natl Cancer Inst. 92 (11): 937–9. PMID 10841830. {{cite journal}}: et al.-i üleliigne kasutus kohas: |author= (juhend)
  11. ↑ Schraml, P.; et al. (1999). "Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types". Clin Cancer Res. 5 (8): 1966–75. PMID 10473073. {{cite journal}}: et al.-i üleliigne kasutus kohas: |author= (juhend)
Pärit leheküljelt "https://et.wikipedia.org/w/index.php?title=Koekiip&oldid=5552564"