Ava peamenüü

Isotermiline tiitrimis-kalorimeetria

TermodünaamikaRedigeeri

Molekulidevahelist termodünaamikat iseloomustavad parameetrid on stöhhiomeetria ( ), assotsiatsioonikonstant ( ), vabaenergia ( ), entalpia ( ) ja entroopia ( ). Need parameetrid on omavahel seotud:  .[2] ITC abil on võimalik neid parameetreid mõõta.

RakendusaladRedigeeri

Ravimikandidaatide hindamineRedigeeri

Isotermilise tiitrimis-kalorimeetria mõõtmistulemusi saab kasutada ravimikandidaatide võrdlemiseks. Väärtus   iseloomustab küll ravimi- ja valguvahelist afiinsust, ent erineb sarnaste ravimikandidaatide seast parima leidmiseks sageli liiga vähe. Seetõttu on molekulide võrdlemisel oluline arvesse võtta nii vabaenergia entalpilist kui ka entroopilist komponenti.[3]

Valguga seonduva ravimikandidaadi entroopilise komponendi optimeerimiseks piisab sageli arendatavale ühendile hüdrofoobse osa lisamisest või põhistruktuuri jäigemaks muutmisest. Selle meetodi kasutamist piirab aga ühendi vesilahustuvuse vähenemine. Valk-ligand seondumisel sõltub parameeter   molekulide vahel tekkivate ja katkevate mittekovalentsete sidemete arvust. Seega, kui mõõdetakse soodne (negatiivsem)  , viitab see tugevamale valk-ligand seosele.[3]

Eelnevast lähtuvalt on ravim-valk interaktsiooni   komponendi mõju tõstmine keerulisem kui   mõju suurendamine. Seetõttu hinnatakse soodsama entalpiaga ühendeid paremaks. Seega saab ITC-d kasutada soodsama entalpiaga ravimikandidaadi väljaselgitamiseks.[3]

Ensüümikineetika iseloomustamineRedigeeri

Traditsioonilised ensüümikineetika iseloomustamise meetodid põhinevad kromogeense, fluorogeense või raadioisotoobiga märgistatud ligandi kasutamisel. ITC selliseid piiranguid substraadile ei sea. Erinevalt kolorimeetrilistest meetoditest saab ITC-ga ensümaatilisi muundumisi jälgida ka hägustes või mitmefaasilistes reaktsioonides.[1]

Makromolekulaarsete komplekside uurimineRedigeeri

Isotermilist tiitrimis-kalorimeetriat on kasutatud translatsiooni lõpetamise mehhanismi uurimiseks.[4]

SeadeRedigeeri

 
Isotermilise tiitrimis-kalorimeetria seade

ITC seade koosneb kahest ühesugusest anumast, mis on ümbritsetud isoleeriva materjaliga. Mõlemal anumal on andurid, mis reguleerivad küttekehade sisse- ja väljalülitamist nii, et temperatuur anumates oleks võrdne. Katse läbiviimiseks täidetakse proovianum uuritava aine (makromolekuli) lahusega ning võrdlusanum vee või puhverlahusega. Enne titrandi lisamist soojendatakse võrdlusanumat. See aktiveerib proovianuma tagasiside-küttekeha. Nii saadakse energiakogus ajaühiku kohta, mis kulub anumate ja lahuste temperatuuri hoidmiseks.[2]

Molekulaarse seondumise mõõtmiseks lisatakse proovilahusele kindlate koguste (alikvootide) kaupa titranti. Selle mõjul soojus kas vabaneb või neeldub ja proovi temperatuur muutub. Eksotermilise reaktsiooni puhul vähendatakse tagasiside-küttekeha kulutatavat energiat, aga endotermilise puhul energiat suurendatakse. See soojushulk ajaühiku kohta (μcal/s) ongi ITC seadme mõõtmistulemus.[1]

Soojuse muut proovis on võrdeline seotud titrandi osakaaluga.[2]

Katse käikRedigeeri

Proovi ettevalmistamineRedigeeri

Ka mõõtmiseks on oluline, et uuritavate proovide kontsentratsioonid oleks väga täpselt määratud. Ka on tähtis, et proovi-lahuse kontsentratsioon valitaks nii, et proov seonduks titrandiga järk-järgult, mitte ei küllastuks uuritav aine titrandi esimese lisamisega.[2]

Proovi- ja võrdlusanuma täitmineRedigeeri

Võrdlusanum peaks olema täidetud vee või naatriumasiidi 0,01% lahusega. Kui masinaga töötatakse pidevalt, peaks võrdlusanuma lahust vahetama vähemalt kord nädalas. Proovianuma täitmisel on oluline, et sinna ei satuks õhumulle.[2]

Titrandi lisamise süstla täitmineRedigeeri

Titrandi lahuse kontsentratsiooni peaks valima nii, et viimase alikvoodi lisamise järel on titrandi kontsentratsioon ligikaudu 2x suurem kui uuritava molekuli kontsentratsioon.[2]

Katse parameetrite valikRedigeeri

ITC seadme tarkvara abil saab muuta alikvootide arvu, lisamise kiirust ja mahtu. Reaktsiooni entalpia mõõtmiseks peaks esimeste alikvootide lisamisel kogu ligand seonduma uuritava ainega. Ka peaks alikvoote lisama pärast uuritava aine küllastumist ligandiga. Küllastumisjärgsete proovide lisamisest eraldunud või neeldunud energia näitab lahuse lahjendamise soojusefekti.[2]

Kontrollkatsed lahjendamise soojusefektide väljaselgitamiseksRedigeeri

Esialgse katse tulemused võib kanda graafikule normaliseerituna: kilokalorit mooli lisatud ligandi ning ligandi ja uuritava aine molaarsuhte vahelise seosena. Saadavat isotermi mõjutab ka lahuste lahjendamisega ning lahuse segamisega kaasnev soojusefekt. Seega peab tegema järgmised kontrollkatsed:

  1. Titrant tiitrida puhverlahusesse ehk lahus ilma uuritava aineta.
  2. Puhverlahus tiitrida uuritava aine lahusesse.

Nende katsete tulemuste abil saab leida korrektse seondumise isotermi.[2]

AndmeanalüüsRedigeeri

 
ITC katse tulemus. Pikiteljel kuluv energia, horisontaalteljel aeg

Esmalt väljendatakse saadud seondumissoojused titrandi kontsentratsiooni funktsioonina. Seejärel piikidealune ala integreeritakse kas piikhaaval ja käsitsi või tarkvara abil. Ligandita makromolekuli kontsentratsioon väheneb iga järjestikuse titrandi lisamisega kuni järjestikused piigid saavad ühekõrguseks. Need piigid (soojushulgad) tekivad lahustumisest ja muudest mehaanilistest efektidest ja sellepärast peab need lahutama kõikidest teistest piikidest. Korrektsete andmete saamiseks on tähtis valida esimeste andmepunktide põhjal õige algtase (baseline).[2]

Pärast algtaseme ja mehaaniliste efektide suhtes korrigeerimist iseloomustab i-nda piigi alust ala ja reaktsioonis neeldunud või eraldunud soojust võrrand

 

kus   on lisatud lahuse ruumala ja   on markomolekuliga seotud ligandi kontsentratsiooni tõus pärast i-ndat lahuse lisamist. Reaktsiooni entalpia, seondumiskonstandi ja stöhhiomeetria arvutamiseks tuleb võrrand viia funktsionaalsele kujule, mis sõltub uuritavate ainete seondumismehhanismist.[5]

Kõrge seondumisafiinsusega reaktsioonide uurimineRedigeeri

On teada, et ITC-ga reaktsiooni mõõtmiseks peab parameeter   olema väiksem kui 1000.[6] See seab Ka-le piiri 108-109 M−1 juurde. Kõrgemate c väärtuste juures kaotab piikide jaotus iseloomuliku S-kuju.[5]

Kõrgema Ka puhul kasutatakse asendus (displacement) ITC tehnikat, kus uuritav makromolekul on juba enne tiitrimist seotud mõne madalama afiinsusega ligandiga. Selle tehnika puhul on vajalikud kolm erinevat tiitrimist:

  • tiitrimine madala afiinsusega ligandiga,
  • tiitrimine kõrge afiinsusega ligandiga (seondumisentalpia määramiseks),
  • asendustiitrimine.[5]

Protoneerimise roll seondumisenergia mõõtmiselRedigeeri

Paljude seondumisreaktsioonide puhul seondub või vabaneb ligandilt või valgult prootoneid. Sel juhul on reaktsioon pH-sõltuv ja seondumisentalpia sõltub puhvri ionisatsioonientalpiast. Prootonite energeetilise rolli hindamiseks tuleks katsed teha erinevate ionisatsioonientalpiatega (ΔHion) puhvrites. Seondumise mõõdetud entalpia on kahe näitaja summa.

 

Seondumisenergia   sõltub pH-st, aga mitte puhvrist endast. Teine komponent on prootoni ionisatsioonienergia   ja liidetud prootonite arvu   korrutis. Kui  , siis on reaktsiooni mõõtmise tulemus prootonite vahetumisest sõltuv.[5]

ViitedRedigeeri

  1. 1,0 1,1 1,2 Ghai, Rajesh; Falconer, Robert J.; Collins, Brett M. (2012). "Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research-survey of the literature from 2010". Journal of Molecular Recognition 25 (1): 32–52. PMID 22213449. doi:10.1002/jmr.1167. 
  2. 2,0 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,7 2,8 Pierce, Michael M.; Raman, C.S.; Nall, Barry T. (1999). "Isothermal Titration Calorimetry of Protein–Protein Interactions". Methods 19 (2): 213. PMID 10527727. doi:10.1006/meth.1999.0852. 
  3. 3,0 3,1 3,2 Ladbury, John E.; Klebe, Gerhard; Freire, Ernesto (2009). "Adding calorimetric data to decision making in lead discovery: a hot tip". Nature Reviews Drug Discovery 9 (1): 23–27. ISSN 1474-1776. doi:10.1038/nrd3054. 
  4. Kononenko, A. V.; Mitkevich, V. A.; Atkinson, G. C.; Tenson, T.; Dubovaya, V. I.; Frolova, L. Y.; Makarov, A. A.; Hauryliuk, V. (2009). "GTP-dependent structural rearrangement of the eRF1:eRF3 complex and eRF3 sequence motifs essential for PABP binding". Nucleic Acids Research 38 (2): 548–558. ISSN 0305-1048. doi:10.1093/nar/gkp908. 
  5. 5,0 5,1 5,2 5,3 Leavitt, Stephanie; Freire, Ernesto (2001). "Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry". Current Opinion in Structural Biology 11 (5): 560. PMID 11785756. doi:10.1016/S0959-440X(00)00248-7. 
  6. Wiseman, Thomas; Williston, Samuel; Brandts, John F.; Lin, Lung-Nan (1989). "Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter". Analytical Biochemistry 179 (1): 131–7. PMID 2757186. doi:10.1016/0003-2697(89)90213-3.