Kümotrüpsiin
Kümotrüpsiin on seedekulgla seedeensüüm, mis lagundab kaksteistsõrmiksooles valke ja polüpeptiide. Seda protsessi nimetatakse protolüüsiks.[1] Kümotrüpsiin lõhub eelistatult peptiidi amiidsidemeid, kus karboksüülne osa amiidsidemest (P1 asendis – asend, mis laguneb esimeses järgus) on äärmiselt hüdrofoobne aminohape (türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin). Need aminohapped sisaldavad oma kõrvalahelas aromaatset tuuma, mis sobib hästi ensüümi "hüdrofoobsesse taskusse" (P1 asendis). See sobitamine toimib aktiveerituna ainult trüpsiini juuresolekul. Peptiidsubstraadi P1 kõrvalahela ja ensüümi S1 (asend, mis laguneb teises järgus) siduva süvendi hüdrofoobsus ja kuju täiendavad üksteist. Need täiendavad üksteist ainult tänu vastava ensüümi substraadi eripäradele.[2][3] Kümotrüpsiin hüdrolüüsib aeglaselt ka teisi amiidsidemeid peptiidides, eriti neid, milles P1 asendis sisalduvad leutsiin ja metioniin.
Struktuuriliselt on see arhetüüpne struktuur, mis kuulub proteaaside hulka.
Ajalugu muuda
1900. aastate algul käis Horace Middleton Vernon välja idee, et kõhunääre võib aktiviseerida omaenda ensüüme. Vernon leidis piima hüübimise katsetega, et on vähemalt kaks vastavat ensüümi ja üks on teisest stabiilsem. Siiski ei saanud see idee heakskiitu 1934. aastani, mil Moses Kunitz ja John Northrop kinnitasid lisaks trüpsiinile ka teise ensüümi olemasolu, nimetades seda kümotrüpsiiniks. Nad kristalliseerisid selle, nagu ka mitteaktiivse eellase kümotrüpsinogeeni. 1938. aastal nimetas Kunitz aktiivsed kümotüpsiini vormid: alfa, beeta ning gamma.
1940. aastate algul uurisid kümotrüpsiini eripärasid Joseph Fruton ja Max Bergmann. Nad leidsid mitmeid uusi substraate. Peagi tegi Albert Jacobson kindlaks uued vormid, nimetades need delta- ja pii-vormiks. 1948. aastal kirjeldas George William Schwert esmakordselt kümotrüpsiini ja kümotrüpsinogeeni omadusi täpsemalt.
1954. aastal leiti esimesi tõendusmaterjale kümotrüpsiini kolmeetapilisest amiidide ja estri substraatide hüdrolüüsist. Brian Selby Hartley ja Bernard Kilby oletasid, et selline hüdrolüüs esineb atsüülensüümi vaheühendi olemasolekul. 1955. aastal avastas Michael Laskowski teise kristallilise kümotrüpsinogeeni, nimetades selle B-kümotrüpsinogeeniks. 1964. aastal määras Hartley A-kümotrüpsiini aminohappe järjestuse, mille Bill Meloun kinnitas 1966. aastal. Alates 1968. aastast kinnitas Iain Smillie B-kümotrüpsiini aminohappe järjestuse, millel on 80%-line sarnasus A-kümotrüpsiiniga. 1970-ndatel ja 1980-ndatel töötati selle kallal, et mõista paremini reaktsioonimehhanisme ja tuvastada trüpsiini ja kümotrüpsiini aminohappe järjestuserinevusi.[4]
Struktuur muuda
Esmase struktuuri järgi on disulfiidsidemetel valkude sidumisel väga tähtis roll. Valk on sfääriline ning koosneb kolmest polüpeptiidahelast. Lisaks on kümotrüpsiinil ka tasku, mida nimetatakse aktiivseks alaks. See ala sisaldab katalüütilist triaadi (Ser-195, His-57 ja Asp-102). Ser-195 on vesiniksidemega seotud His-57-ga, mis omakorda on vesiniksidemega seotud Asp-102 jäägiga. His-57 ülesandeks on positsioneerida Ser-195 jääke ja polariseerida hüdroksüülrühma, et seda võiks deprotoneerida alkosiidiooniks. Substraadi juuresolekul võtab see vastu prootoni, käitudes ise alusena. Asp-102 suunab His-57-t ja stabiliseerib seda vesiniksideme ja elektrostaatika kaudu.[5]
Aktiveerimine muuda
Kümotrüpsiini, mis on eelkäijaks kümotrüpsinogeenile, sünteesitakse kõhunäärmes valgusünteesi käigus. Trüpsinogeen on ensümaatiliselt mitteaktiivne. Trüpsiin aktiveerib kümotrüpsinogeeni, lõhkudes tema peptiidsidemeid positsioonidel Arg15 – Ile16, tekitades π-kümotrüpsiini. Seejärel reageerib Ile16 aminorühm (-NH3+) Glu194 kõrvalahelaga, saades "oksüaniooni augu" ja hüdrofoobse "S1 tasku". Lisaks soodustab kümotrüpsiin oma aktiivsust, lõhkudes sidemeid positsioonidel 14–15, 146–147 ja 148–149, tekitades α-kümotrüpsiini (mis on isegi aktiivsem ja stabiilsem kui π-kümotrüpsiin). Lõpptulemuseks on kolme polüpeptiidiga molekul, mis on omavahel ühendatud disulfiidsidemetega.
Spetsiifilisus muuda
Kümotrüpsiin aktiveerub, kui trüpsiin lõhub arginiini ja isoleutsiini (R15 ja i16) vahelise sideme. Niiviisi struktuur muutub. Kümotrüpsiin erineb trüpsiinist selle poolest, et trüpsiin lõhub peptiide arginini ja lüsiini jääkidest, samas eelistab aga kümotrüpsiin suuri hüdrofoobseid jääke. Kümotrüpsiin katalüüsib eelistatult peptiidsidemete hüdrolüüsi, sealhulgas türosiini L-isomeere, fenüülalaniini ja trüptofaani. Samuti reageerib see kergesti tundlike amiidide ja estritega vastavas aminohappes.
Kuigi trüpsiini ja kümotrüpsiin S1 struktuuridel on ainult üks erinevus (positsioonil 189), siis vastavate ainete mutagenees pole suutnud vahetada nende spetsiifilisusi. See viitab, et mehhanism, millega trüpsiin ja kümotrüpsiin saavutavad substraadi spetsiifilise katalüüsi, pole veel täielikult teada.[4]
Toimemehhanism ja kineetika muuda
In vito kümotrüpsiin on proteolüütiline ensüüm, mis toimetab paljude organismide seedeelundkondades. Kümotrüpsiin aitab hüdrolüüsireaktsiooniga lõhkuda peptiidsidemeid, mis on termodünaamiliselt väga soodne, kuid samas katalüsaatori puudumisel väga aeglane reaktsioon. Peamised kümotrüpsiini substraadid sisaldavad trüptofaani, türosiini, leutsiini ning fenüülalaniini, mis lõhutakse C-terminaalses karboksüülhappes. Nagu paljud proteaasid, hüdrolüüsib ka kümotrüpsiin in vitro amiidsidemeid, tänu millele on võimalik substraatide analoogide kasutus, näiteks N-atsetüül-L-fenüülalaniini p-nitrofenüül amiidi ensüümianalüüs.
Kümotrüpsiin lõhub peptiidsidemeid, rünnates nende mitteaktiivset karbonüülrühma tugeva nukleofiili, seriin-195 sademega. See asub ensüümi aktiivsel alal ja muudab peptiidsideme substraadiga seoses nõrgalt kovalentseks sidemeks, moodustades ensüümsubstraadi vaheühendi. Koos histidiin-57 ja asparagiinhape-102-ga moodustab see seriini sade aktiivsel alal katalüütilise triaadi.
Need tulemused on saadud inhibitsioonitestidega ja eespool nimetatud ensüümsubstraadi lõhkumise kineetikauuringutega. Nende tulemustest ilmnes asjaolu, et ensüümsubstraadi vaheühend p-nitrofenolaat on kollast värvi, võimaldades mõõta kontsentratsiooni valgusneeldumise lainepikkusel 410 nanomeetrit.
Kümotrüpsiini ja selle substraadi reaktsioon toimub kahes osas, millest esimene on purse reaktsiooni alguses. Teine osa on rahulik ja püsiv ning järgib Michaelise-Menteni kineetikat. Seda kutsutakse ka ping-pongi mehhanismiks. Kümotrüpsiini toimemehhanism selgitab seda kui hüdrolüüsi kahes osas toimumist. Esimene on substraadi atsüülimine, et saada atsüülensüümi vaheühend, ning teine on deatsüülimine, et viia ensüüm tagasi varasemasse algolekusse. See toimib koostöös kolme aminohappejäägiga katalüütilises triaadis.[6] Aspartaataminotransferaasi vesinikud seovad end histidiini N-δ vesinikkude külge, kasvatades ε-lämmastiku pKa, ja seega võimaldavad sel deprotoneerida seriini. See on deprotoneerimine, mis lubab seriini kõrvalharul käituda nukleofiilina ja siduda end valgu peaahela puuduva elektroniga karbonüülsüsiniku juurde. Karbonüülrühma hapniku ioniseerimine stabiliseeritakse kahe vesiniksideme kõrvuti asetamisega peaahela N-vesinikkude juures. See esineb oksüaniooni augus ja tekitab tetraeedrilise adukti ning lõhub ära peptiidsideme. Tekib seriini külge seotud atsüülensüümi vaheühend ning lõhutud valgu N-terminaalne aminohape saab dissotsieeruda. Teises reaktsioonietapis aktiveerib histidiin vee molekuli ja käitub kui nukleofiil. Hapniku molekul vees ründab seriiniga ühendatud atsüülrühma karbonüülsüsinikku: tekitab teise tetraeedrilise adukti, taastab seriini –OH rühma ning vabastab prootoni ja osa valgust tekkinud uue C-terminaali karboksüülhappe.[6]
Vaata ka muuda
Viited muuda
- ↑ Wilcox PE (1970). "Chymotrypsinogens – chymotrypsins". Methods in Enzymology. Methods in Enzymology. 19: 64–108. doi:10.1016/0076-6879(70)19007-0. ISBN 978-0-12-181881-4.
- ↑ Appel W (December 1986). "Chymotrypsin: molecular and catalytic properties". Clin. Biochem. 19 (6): 317–22. doi:10.1016/S0009-9120(86)80002-9. PMID 3555886.
- ↑ Berger A, Schechter I (February 1970). "Mapping the active site of papain with the aid of peptide substrates and inhibitors". Philos. Trans. R. Soc. Lond., B, Biol. Sci. 257 (813): 249–64. doi:10.1098/rstb.1970.0024. PMID 4399049.
- ↑ 4,0 4,1 Biochemical Corporation, Worthington. "Chymotrypsin"http://www.worthington-biochem.com/chy/default.html
- ↑ Wikibooks (2016), "Structural Biochemistry/Enzyme Catalytic Mechanism/Proteases/Chymotrypsin – Structure of Chymotrypsin""https://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Enzyme_Catalytic_Mechanism/Proteases/Chymotrypsin
- ↑ 6,0 6,1 Petsko, Gregory; Ringe, Dagmar (2009). Protein Structure and Function. Oxford: Oxford University Press. pp. 78–79. ISBN 978-0-19-955684-7.