Erinevus lehekülje "Immunofluorestsents" redaktsioonide vahel

Selle metoodika abil saab välja selgitada huvipakkuvate biomolekulide asukohta erinevates rakkudes ningja kudedes. Metoodika aluseks on antikehade spetsiifilisus oma antigeenile. Immunofluorestsentsmeetod võimaldab teadlastel kindlaks määrata, kas uuritavades rakkudes ekspresseerub mingi spetsiifiline antigeen. Immunofluorestsentsmeetodit saab rakendada [[rakukultuur]]idele, koelõikudele või individuaalsetele rakkudele. Selle meetodiga saab analüüsida [[valkude]], [[glükaanide]] ning väikeste bioloogiliste molekulide jaotust uuritavas proovis.<ref>[http://www.sinobiological.com/principle-of-immunofluorescence.html Principle of Immunofluorescence] Sinobiological koduleht (vaadatud 27.10.2017)</ref> Immunofluorestsentsi saab kasutada kombinatsioonis mõne muu fluorestsentsil põhineva värvimisega, näiteks kasutades [[DAPI]]-t (4',6-diamino-2-fenüülindool) [[DNA]] märgistamiseks. Saadud preparaate saab uurida [[fluorestsentsmikroskoop|epifluorestsentsmikroskoobiga]] ningja [[konfokaalmikroskoop|konfokaalmikroskoobiga]]. Kasutada saab ka erinevaid [[superresolutsioonmikroskoop]]e, mis on palju suurema [[lahutusvõime]]ga.<ref>[https://rockland-inc.com/fluorescence_microscopy.aspx Immunofluorescence Microscopy] Rockland antibodies and assays koduleht (vaadatud 27.10.2017)</ref>

'''Kaudse ehk sekundaarse''' immunofluorestsentsi puhul tehakse kaheetapiline inkubatsioon. Kõigepealt tunneb primaarne antikeha ära sihtmärkstruktuuri. Seejärel lisatakse fluorokroomiga märgistatud sekundaarne antikeha, mis seondub spetsiifiliselt primaarse antikehaga. See spetsiifilisus saavutatakse nii, et sekundaarne antikeha on tehtud selle looma vastu, milles primaarne antikeha on toodetud. Näiteks kui primaarne antikeha on toodetud jäneses, siis peaks kasutama jänese vastast sekundaarset antikeha. Mõlemal meetodil on nii oma tugevused kui ka puudused.

Otsene immunofluorestsents on kiirem meetod, kuid hea tulemuse saamiseks on vaja, et kasutatav antikeha oleks võimalikult hästi funktsioneeruv ningja kõrgesuure [[afiinsus (biokeemia)|afiinsusega]] oma antigeeni suhtes.

Fikseerimine on immunofluorestsentsi protokolli kõige esimene etapp. Fikseerimise eesmärgiks on säilitada rakke, rakulisi moodustisi või [[kude]]t oma hetkelises seisukorras. Fikseerimise juures on oluline see, et rakulised struktuurid jääksid oma natiivsesse vormi nii kauaks kui võimalik. Immunofluorestsentsil kasutatakse mitmesuguseid fikseerimise meetodeid ning need võivad primaarse antikeha [[epitoop|epitoobile]] erinevalt mõjuda. Antikeha seondumiskohad võivad fikseerimise tagajärjel maskeeruda või kahjustuda ning see nõrgendab immunofluorestsentsi kvaliteeti. Kuna paljud antikehad seonduvad fikseerimisühenditest sõltuvalt erinevalt oma antigeeniga, siis on uue antikeha kasutamisel vaja testida erinevaid fikseerimismeetodeid.

Fikseerimisreagente saab jaotada kaheks: keemilised ristsidujad ja orgaanilised lahustid. Keemilised ristsidujad nagu näiteks [[formaldehüüd]] ristseovad valke nende vabade [[funktsionaalrühm|aminorühmade]] kaudu. Enamasti raku [[morfoloogia]] seejuures säilitatakse, kuid antigeenid ristseotakse samuti ning see võib vähendada antikeha seondumist. Orgaanilised lahustid nagu näiteks [[metanool]] ja [[atsetoon]] on vett eemaldava toimega ja sadestavad valkusid ning on seetõttu rakke fikseeriva toimega. Sellise fikseerimise puhul aga kaotatakse palju rakus leiduvaid lahustuvaid ühendeid ningja [[lipiid]]seid komponente. Tihti kasutatakse metanooli ja atsetooni koos, sest kuigi metanool on parim vahend rakuliste struktuuride säilitamiseks, on tal kahjustav efekt paljudele epitoopidele. Kui primaarse antikeha tootja pole ühtegi fikseerimise meetodit soovitanud, siis enamikule [[rakuliin]]idele ja antigeenidele sobib 4% formaldehüüdi lahus 10 minuti jooksul toatemperatuuril.<ref name="Florian Hoff"/>

Permeabiliseerimise käigus tehakse [[rakumembraan]]i augud (kuid ei eemalda kogu rakumembraani) ning– see aitab antikehadel pääseda fikseeritud rakkudesse, sest tavaolukorras ei suuda antikehad membraani läbida. Kui rakke fikseerida orgaaniliste lahustitega, siis rakumembraanid muutuvad läbitavaks ning eraldi permeabiliseerimise protseduuri pole tarvis läbi viia. Keemiliste ristsidujatega fikseerides on aga permeabiliseerimine vajalik. Permeabiliseerimiseks kasutatakse mitmeid [[detergent]]e, nagu näiteks [[NP-40]], [[Triton X-100]], [[Tween-20]] ja [[saponiin]]. Raku pinnal asuvaidasuvate valkevalkude uuridesuurimisel pole permeabiliseerimine vajalik. Fikseerimine ja permeabiliseerimine mõjutavad raku morfoloogiat ja uuritava antigeeni kättesaadavust.<ref>[https://microscopy.duke.edu/guides/intro-sample-prep-immunofluorescence Introduction to Sample preparation: Immunofluorescence] Duke University koduleht (vaadatud 27.10.2017)</ref>

Blokeerimine on vajalik mittespetsiifilise värvimise takistamiseks ehk selleks, et antikehad ei seonduks millegi muuga kui vaid oma antigeeniga. Ebapiisava blokeerimise tõttu võib tulemuste analüüsimisel olla liiga palju segavat taustamüra ning ülemäärase blokeerimise tagajärjeks võib olla see, et signaal on nõrk või puudub. Blokeerimisel võib kasutada ükskõik missugust valku, mis ei seondu huvialuse valgu epitoobiga ega immunofluorestsentsil kasutatavate antikehadega. Sagedasti kasutatakse normaalse seerumi valke, mis on toodetud samas loomaliigis, milles kasutatav sekundaarne antikeha. Levinud on ka valgupuhvrite, näiteks [[veise seerumi albumiin]]i (BSA) ningja rasvavaba piimalahuse kasutamine.<ref>[https://bitesizebio.com/13466/immunohistochemistry-basics-blocking-non-specific-staining/ Immunohistochemistry Basics: Blocking Non-Specific Staining] Bitesize Bio koduleht (vaadatud 27.10.2017)</ref>

Tavaliselt värvitakse tuumad pealepärast immunoreaktsiooni DNA värvidega. Kõige enamkasutatavamadkasutatavamad DNA värvid on [[DAPI]] ja [[Hoechsti värv]]. Tuumade värvimine aitab hiljem mikroskopeerimisel paremini rakkude või kudede suhtes orienteeruda ning samuti saadakse infot [[rakutsükkel|rakutsükli]] kohta, näiteks kas rakud on [[mitoos]]is või mitte. Tuumade värvimiseks lahustatakse värv [[PBS]]-is (fosfaatpuhverdatud soolalahuses) ning inkubeeritakse preparaati 10 minutit toatemperatuuril.

Pärast immunofluorestsentsiprotokolli läbimist tuleb preparaadid sulustada, et neid saaks mikroskoobis vaadata. Selleks kasutatakse kommertsiaalseid paigaldusmeediume (''mounting medium''), mis kinnitavad proovi katteklaasi ningja alusklaasi vahele janing takistavad preparaadist vee aurustumist. On olemas ka paigaldusmeediumid, milles on juba DNA värvid sees. PealePärast paigaldusmeediumiga sulustamist peab laskma preparaadil kuivada. Järgmisel päeval on preparaat valmis mikroskoobiga vaatamiseksuurimiseks.<ref name="Florian Hoff"/>