Erinevus lehekülje "Transformatsioon (geneetika)" redaktsioonide vahel

P
pisitoimetamine
P (Homoloogiline rekombinatsioon)
P (pisitoimetamine)
Esmakordselt demonstreeris transformatsiooni toimumist aastal 1928 briti bakterioloog [[Frederick Griffith]], kes tegeles kahe ''[[Streptococcus pneumoniae]]'' tüve uurimisega. Kui Griffith süstis hiiri ohutu tüve (II-R) bakterite või kuumusega tapetud haigust tekitava tüve (III-S) bakteritega, jäid hiired ellu, kuid nende kahe kombinatsioon osutus hiirtele surmavaks. Surnud hiirte verest õnnestus tal isoleerida mõlema tüve elusaid rakke ning järeldas sellest, et mingi seaduspära järgi on võimalik ühe bakteritüve muundumine teiseks. Tema mõtet arendasid edasi [[Oswald Avery]], [[Colin MacLeod]] ja [[Maclyn McCarty]], kes tõestasid aastal 1944, et tegu on geneetilise materjali ülekandega. Kasutades samu tüvesid, isoleerisid nad [[virulentsus|virulentse]] tüve DNA ja näitasid, et selle viimisest II-R tüvesse piisab, et kahjutu tüvi samuti virulentseks muutuks, kummutades sellega tol ajal laialt levinud arusaama, et [[valk|valgud]] on pärilikkust kandvaks materjaliks. DNA hõivamist väliskeskkonnast rakku ja selle arvamist raku enese DNA hulka hakkasid nad nimetama transformatsiooniks. Algul suhtuti nende avastusse küll suure umbusuga, kuid geneetiliste markerite kasutuselevõtt ja teiste geneetilise materjali ülekandemeetodite avastamine [[Joshua Lederberg]]i poolt <ref name="e5qmL" /> (konjugatsioon 1947. ja transduktsioon 1953. aastal) veenis teaduskogukonda Avery tulemusi tunnustama.
Siiski oldi üsna veendunud, et ''[[Escherichia coli]]'' ei ole transformatsioonialdis. Alles aastal 1970 näitasid [[Morton Mandel]] ja [[Akiko Higa]], <ref name="vP5SH" /> et [[kaltsiumkloriid]]i lahusega töötlemise tagajärjel on E. coli võimeline väliskeskkonnast ilma faagi abita bakteriofaagi DNA-d inkorporeerima. Paar aastat hiljem tõestasid Stanley Cohen, Annie Chang ja Leslie Hsu,<ref name="LzP4l" /> et sarnane meetod on efektiivne ka [[plasmiid]]se DNA puhul. Mandeli ja Higa meetodit arendas hiljem edasi [[Douglas Hanahan]].<ref name="CpFJs" /> Kunstlikult tekitatud kompetentsuse võimalikkus ''E. coli'' kui laialdaselt kasutatava [[mudelorganism]]i puhul pani aluse mugava ja efektiivse metoodika arendamisele bakterite transformeerimiseks, mis võimaldab [[biotehnoloogia]]s ja teadustöös kasutada varasemast oluliselt lihtsamaid molekulaarse [[kloneerimine|kloneerimise]] võtteid. Praeguseks on transformatsiooni näol tegu igapäevase laboriprotseduuriga.
Transformatsioon [[elektroporatsioon]]i teel arendati välja 1980. aastate lõpul, tuues kaasa ''[[in-vitro]]'' transformatsiooni efektiivsuse tõusu ja võimaluse enamate bakteritüvede transformatsiooniks.<ref name="LdLsW" /> Uuriti ka taime- ja loomarakkude transformeerimise võimalusi, mis päädis esimese [[transgeenne|transgeense]] hiire loomisega aastal 1982, süstides hiire [[embrüo]]sse geeni roti kasvuhormooni jaoks.<ref name="ruJCf" /> Varajastel 1970. aastatel avastati, et Ti-plasmiid ''[[Agrobacterium tumefaciens]]''′i rakkudes on põhjuseks, miks antud bakter taimedele kasvajaid tekitab.<ref name="CRTnO" /> [[Ti-plasmiid]] integreerub taime [[genoom]]i,<ref name="s98pO" /> kutsudes esile tuumorite teket. Asendades Ti-plasmiidis kasvajat tekitava geeni mõne muu huvipakkuva [[geen]]iga, on võimalik ''A. tumefaciens''’iga taimi nakatades [[kaheiduleheline|kaheiduleheliste]] taimede genoomi viia valitud DNA. [[Üheiduleheline|Üheiduleheliste]] ja mõningate teiste ''A. tumefaciens''’i suhtes tundetute taimede transformatsiooniks kasutatakse elektroporeerimist ning [[mikro-injektsioon]]i.<ref name="fdfJg" /> [[Biolistiline|Biolistilise]] meetodi ehk raku pommitamise geneetilise materjaliga kaetud metalliioonidega võttis 1990. aastal kasutusele [[John Stanford]].<ref name="4ypbk" />
Lihtsaim neist on transformatsioon ''Agrobacterium tumefaciens''’i abil. Selleks lõigatakse taime kude, milleks tavaliselt on [[leht]], väikesteks tükkideks ja leotatakse umbes kümme minutit ''Agrobacterium''’i sisaldavas [[suspensioon]]is. Servmised rakud, mis asuvad lõikepinnal, saavad bakteri poolt transformeeritud. Kui selliselt töödeldud koetükid juurdumise ja võrsekasvu suhtes selektiivsel söötmel üles kasvatada, saadakse geneetiliselt teisenenud taimed. Mõnede taimeliikide puhul piisab ka sellest, kui nende õis bakterisuspensiooni kasta ja hiljem seemned selektiivsele söötmele külvata. Paljusid taimeliike antud meetodiga siiski modifitseerida ei saa. Väga suur osa taimedes on transformeeritavad kulla- või volframiosakestega pommitamise teel. Selleks kaetakse metalliosakesed DNA-ga ning tulistatakse noortesse taimerakkudesse või taimeembrüosse. Efektiivsus on sel meetodil küll madalam kui ''Agrobacterium''’i kasutades, kuid võimalike mõjustatavate taimede valik on oluliselt laiem. Samuti on suureks eeliseks see, et nii saab transformeerida ka taime plastiide. Kolmandaks võimaluseks on taimerakkude elektroporatsioon, mis toimib sarnaselt bakterite puhul kirjeldatule.
 
Geneetilist materjali on võimalik taimerakkudesse viia ka mitmete [[viirus|taimeviiruste]] abil, kuid see pole transformatsioon, vaid [[transduktsioon]] rakku viidav info on pakitud viiruskapslisse. Kuna suurem osa taimeviirustest on ssRNA-viirused, kelle pärilik materjal tsütoplasmas replitseerub, siis enamasti saab sel moel mõjustada vaid üht põlvkonda rakke. Nakatatud taime järglased ei ole viirusega nakatunud ega kanna endas sisestatud geeni. DNA-viirused seevastu on võimelised kromosoomidega [[Homoloogiline rekombinatsioon|rekombineeruma]], tekitades taime genoomis püsivaid muutusi, mistõttu kandub selline ümberkorraldus üle ka järglastele.
 
===Loomad===
 
DNA viimist loomsetesse rakkudesse nimetatakse harilikult [[transfektsioon]]iks. Ka sel puhul muudetakse rakusein erinevate võtete abil auklikuks, et soovitud materjal rakku liikuda saaks. Transfektsioon ei tähenda ainult DNA viimist rakku, selleks võib olla näiteks siRNA konstrukt või valk (näiteks antikeha). Transfekteerimiseks kasutatakse kaltsiumfosfaati, elektroporatsiooni või segatakse rakku viidav aine katioonsete lipiididega, moodustamaks [[liposoom]]e, mis membraaniga kokku sulades sisaldise rakku viivad.
 
==Praktilisi külgi molekulaarbioloogias==
 
[[CFU]] ehk ''colony forming unit'' väljendab eluvõimeliste rakkude hulka näites milliliitris lahuses. Väikese plasmiidi, nagu pUC19, puhul tähendab transformatsiooniefektiivsus 1×10<sup>8</sup> cfu/μg seda, et umbes 1 plasmiid 2000 hulgast läheb rakku sisse.
Keemiliste kompetentide puhul hoitakse rakke jää peal külmas CaCl<sub>2</sub> lahuses, muutes rakud plasmiidsele DNA-le läbitavaks. Rakke inkubeeritakse jääl plasmiidi juuresolekul ja seejärel kuumutatakse 42 &nbsp;°C juures sõltuvalt metoodikast 30–120 sekundit. Mittetööstuslikud meetodid annavad tulemuseks
keskmiselt 10<sup>6</sup>–10<sup>7</sup> transformanti mikrogrammi plasmiidi kohta. Keemiline meetod toimib rõngasja DNA puhul väga hästi, kuid ei kõlba lineaarsete DNA fragmentide tarvis, arvatavasti seetõttu, et raku eksonukleaasid lagundavad lineaarse DNA kiiresti ära. Looduslikud kompetendid seevastu transformeeruvad lineaarse DNA-ga paremini kui plasmiidsega.
 
Transformatsiooni efektiivsus väheneb plasmiidi suuruse kasvades, mistõttu kasutatakse suuremate DNA molekulide puhul elektroporatsiooni.<ref name="e196P" /> Elektroporeeritavaid rakke on enne töötlust soovitatav pesta külma mitmekordselt destilleeritud veega, eemaldamaks laetud osakesi, mis protsessi käigus sädet anda võiksid.
75 777

muudatust