Immunofluorestsents: erinevus redaktsioonide vahel
Eemaldatud sisu Lisatud sisu
Resümee puudub |
P Afiinsus (biokeemia) |
||
2. rida:
'''Immunofluorestsents''' on [[antigeen]]-[[antikeha]] kompleksi asukoha määramiseks kasutatav meetod, kus antigeeni või antikehaga seotakse [[fluorestsents|fluorestseeruvat]] [[värvaine]]t.<ref>[http://termin.eki.ee/esterm/concept.php?id=37135&term=immunofluorestsents immunofluorestsents] esterm (vaadatud 27.10.2017)</ref> Selle metoodika abil saab välja selgitada huvipakkuvate biomolekulide asukohta erinevates rakkudes ning kudedes. Metoodika aluseks on antikehade spetsiifilisus oma antigeenile. Immunofluorestsentsmeetod võimaldab teadlastel kindlaks määrata, kas uuritavades rakkudes ekspresseerub mingi spetsiifiline antigeen. Immunofluorestsentsmeetodit saab rakendada [[rakukultuur]]idele, koelõikudele või individuaalsetele rakkudele. Selle meetodiga saab analüüsida [[valkude]], [[glükaanide]] ning väikeste bioloogiliste molekulide jaotust uuritavas proovis.<ref>[http://www.sinobiological.com/principle-of-immunofluorescence.html Principle of Immunofluorescence] Sinobiological koduleht (vaadatud 27.10.2017)</ref> Immunofluorestsentsi saab kasutada kombinatsioonis mõne muu fluorestsentsil põhineva värvimisega, näiteks kasutades [[DAPI]]-t (4',6-diamino-2-fenüülindool) [[DNA]] märgistamiseks. Saadud preparaate saab uurida [[fluorestsentsmikroskoop|epifluorestsentsmikroskoobiga]] ning [[konfokaalmikroskoop|konfokaalmikroskoobiga]]. Kasutada saab ka erinevaid [[superresolutsioonmikroskoop]]e, mis on palju suurema [[lahutusvõime]]ga.<ref>[https://rockland-inc.com/fluorescence_microscopy.aspx Immunofluorescence Microscopy] Rockland antibodies and assays koduleht (vaadatud 27.10.2017)</ref>
[[Pilt:Immunofluorescence.jpg|pisi|300px|Need joonised demonstreerivad immunofluorestsentsi peamist mehhanismi. Primaarset ehk otsest immunofluorestsentsi kujutatakse vasakul. Otsese immunofluorestsentsi korral seondub fluorokroomiga konjugeeritud antikeha otse endale spetsiifilise epitoobiga. Kui antikeha on epitoobiga seondunud, saab antigeeni olemasolu kontrollimiseks vaadata proovi fluorestsentsmikroskoobiga. Sekundaarset ehk kaudset immunofluorestsentsi kujutatakse paremal. Sekundaarse immunofluorestsentsi puhul seondub märgistamata primaarne antikeha oma epitoobiga ning seejärel seondub fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarne antikeha spetsiifiliselt primaarse antikehaga. See meetod võimaldab rohkematel fluorokroomiga märgistatud antikehadel seonduda oma sihtmärgiga ning seeläbi suurendada nähtavat signaali mikroskoobiga vaatlemisel
== Otsene ja kaudne immunofluorestsents ==
Olenevalt eksperimendi tüübist, on kaks immunofluorestsentsi meetodit. '''Otsese ehk primaarse''' meetodi puhul seondub [[fluorofoor|fluorokroomiga]] konjugeeritud spetsiifiline primaarne antikeha sihtmärkstruktuuriga (antigeeniga).
'''Kaudse ehk sekundaarse''' immunofluorestsentsi puhul tehakse kaheetapiline inkubatsioon. Kõigepealt tunneb primaarne antikeha ära sihtmärkstruktuuri. Seejärel lisatakse fluorokroomiga märgistatud sekundaarne antikeha, mis seondub spetsiifiliselt primaarse antikehaga. See spetsiifilisus saavutatakse nii, et sekundaarne antikeha on tehtud selle looma vastu, milles primaarne antikeha on toodetud. Näiteks kui primaarne antikeha on toodetud jäneses, siis peaks kasutama jänese vastast sekundaarset antikeha. Mõlemal meetodil on nii oma tugevused kui puudused.
Otsene immunofluorestsents on kiirem meetod, kuid hea tulemuse saamiseks on vaja, et kasutatav antikeha oleks võimalikult hästi funktsioneeruv ning kõrge [[afiinsus (biokeemia)|afiinsusega]]
Kaudse immunofluorestsentsi puhul saab sekundaarseid antikehasid kombineerida erinevate primaarsete antikehadega (arvestades seda, missuguses loomas on primaarne antikeha toodetud). Kaudse immunofluorestsentsi abil saab signaali amplifitseerida, sest mitu sekundaarset antikeha, mis on fluorokroomiga konjugeeritud, saab seonduda primaarse antikehaga ning see viib fluorestsentsi tugevnemiseni. Seetõttu pole tarvis kasutada ka niivõrd suurtes kogustes primaarset antikeha. Kaudne immunofluorestsents võtab küll rohkem aega, kuid on üldkokkuvõttes ökonoomsem ja sobivam meetod enamikule teadlastele.<ref name="Florian Hoff">[http://www.leica-microsystems.com/science-lab/how-to-prepare-your-specimen-for-immunofluorescence-microscopy/ How to Prepare Your Specimen for Immunofluorescence Microscopy] Leica Microsystems koduleht (vaadatud 27.10.2017)</ref>
| |||