Kasutaja:Ivarik/liivakast: erinevus redaktsioonide vahel
Eemaldatud sisu Lisatud sisu
PResümee puudub |
|||
1. rida:
{{Kasutaja liivakast}}
'''Immunofluorestsents''' on antigeen-antikeha kompleksi asukoha määramiseks kasutatav meetod, kus [[antigeen]]i või [[antikeha]]ga seotakse [[fluorestsents|fluorestseeruvat]] [[värvaine]]t. <ref>[http://termin.eki.ee/esterm/concept.php?id=37135&term=immunofluorestsents immunofluorestsents] esterm 27.10.2017</ref> Selle metoodika abil saab välja selgitada huvipakkuvate biomolekulide asukohta erinevates rakkudes ning kudedes. Metoodika aluseks on antikehade spetsiifilisus oma antigeenile. Immunofluorestsentsmeetod võimaldab teadlastel kindlaks määrata, kas uuritavades rakkudes ekspresseerub mingi spetsiifiline antigeen. Immunofluorestsentsmeetodit saab rakendada [[rakukultuur]]idele, koelõikudele või individuaalsetele rakkudele. Selle meetodiga saab analüüsida [[valkude]], [[glükaanide]] ning väikeste bioloogiliste molekulide jaotust uuritavas proovis. <ref>[http://www.sinobiological.com/principle-of-immunofluorescence.html Principle of Immunofluorescence] Sinobiological koduleht 27.10.2017</ref> Immunofluorestsentsi saab kasutada kombinatsioonis mõne muu fluorestsentsil põhineva värvimisega, näiteks kasutades [[DAPI]]-t [[DNA]] märgistamiseks. Saadud preparaate saab uurida [[fluorestsentsmikroskoop|epifluorestsentsmikroskoobiga]] ning [[konfokaalmikroskoop|konfokaalmikroskoobiga]]. Kasutada saab ka erinevaid [[superresolutsioonmikroskoop]]e, mis on palju suurema [[lahutusvõime]]ga. <ref>[https://rockland-inc.com/fluorescence_microscopy.aspx Immunofluorescence Microscopy] Rockland antibodies and assays koduleht 27.10.2017</ref>
== Otsene ja kaudne immunofluorestsents ==
7. rida:
'''Kaudse ehk sekundaarse''' immunofluorestsentsi puhul tehakse kaheetapiline inkubatsioon. Kõigepealt tunneb primaarne antikeha ära sihtmärkstruktuuri. Seejärel lisatakse fluorokroomiga märgistatud sekundaarne antikeha, mis seondub spetsiifiliselt primaarse antikehaga. See spetsiifilisus saavutatakse nii, et sekundaarne antikeha on tehtud selle looma vastu, milles primaarne antikeha on toodetud. Näiteks kui primaarne antikeha on toodetud jäneses, siis peaks kasutama jänese vastast sekundaarset antikeha. Mõlemal meetodil on nii oma tugevused kui puudused.
Otsene immunofluorestsents on kiirem meetod, kuid hea tulemuse saamiseks on vaja, et kasutatav antikeha oleks võimalikult hästi funktsioneeruv ning kõrge [[afiinsus]]ega oma antigeeni suhtes.
Kaudse immunofluorestsentsi puhul saab sekundaarseid antikehasid kombineerida erinevate primaarsete antikehadega (arvestades seda, missuguses loomas on primaarne antikeha toodetud). Kaudse immunofluorestsentsi abil saab signaali amplifitseerida, sest mitu sekundaarset antikeha, mis on fluorokroomiga konjugeeritud, saab seonduda primaarse antikehaga ning see viib fluorestsentsi tugevnemiseni. Seetõttu pole tarvis kasutada ka niivõrd suurtes kogustes primaarset antikeha. Kaudse immunofluorestsents võtab küll rohkem aega, kuid on üldkokkuvõttes ökonoomsem ja sobivam meetod enamikule teadlastele. <ref name="Florian Hoff">[http://www.leica-microsystems.com/science-lab/how-to-prepare-your-specimen-for-immunofluorescence-microscopy/ How to Prepare Your Specimen for Immunofluorescence Microscopy] Leica Microsystems koduleht 27.10.2017</ref>
== Fikseerimine ==
13. rida:
Fikseerimisreagente saab jaotada kaheks: keemilised ristsidujad ja orgaanilised lahustid. Keemilised ristsidujad nagu näiteks [[formaldehüüd]] ristseovad valke nende vabade [[funktsionaalrühm|aminorühmade]] kaudu. Enamasti raku [[morfoloogia]] seejuures säilitatakse, kuid antigeenid ristseotakse samuti ning see võib vähendada antikeha seondumist. Orgaanilised lahustid nagu näiteks [[metanool]] ja [[atsetoon]] on vett eemaldava toimega ja sadestavad valkusid, seetõttu fikseerides neid rakulises kontekstis. Sellise fikseerimise puhul aga kaotatakse palju rakus leiduvaid lahustuvaid ühendeid ning [[lipiid]]seid komponente. Tihti kasutatakse metanooli ja atsetooni koos, sest kuigi metanool on parim vahend rakuliste struktuuride säilitamiseks, on tal kahjustav efekt paljudele epitoopidele. Kui primaarse antikeha tootja pole ühtegi fikseerimise meetodit soovitanud, siis enamikule [[rakuliin]]idele ja antigeenidele sobib 4% formaldehüüdi lahus 10 minuti jooksul toatemperatuuril. <ref name="Florian Hoff"/>
== Permeabiliseerimine ==
Permeabiliseerimise käigus tehakse [[rakumembraan]]i augud (kuid ei eemalda kogu rakumembraani) ning see aitab antikehadel pääseda fikseeritud rakkudesse, sest tavaolukorras ei suuda antikehad membraani läbida. Kui rakke fikseerida orgaaniliste lahustitega, siis rakumembraanid muutuvad läbitavaks ning eraldi permeabiliseerimise protseduuri pole tarvis läbi viia. Keemiliste ristsidujatega fikseerides on aga permeabiliseerimine vajalik. Permeabiliseerimiseks kasutatakse mitmeid [[detergent]]e, nagu näiteks [[NP-40]], [[Triton X-100]], [[Tween-20]] ja [[saponiin]]. Raku pinnal asuvaid valke uurides pole permeabiliseerimine vajalik. Fikseerimine ja permeabiliseerimine mõjutavad raku morfoloogiat ja uuritava antigeeni kättesaadavust. <ref>[https://microscopy.duke.edu/guides/intro-sample-prep-immunofluorescence Introduction to Sample preparation: Immunofluorescence] Duke University koduleht 27.10.2017</ref>
== Blokeerimine ==
Blokeerimine on vajalik mittespetsiifilise värvimise takistamiseks ehk selleks, et antikehad ei seonduks millegi muuga kui vaid oma antigeeniga. Ebapiisava blokeerimise tõttu võib tulemuste analüüsimisel olla liiga palju segavat taustamüra ning ülemäärase blokeerimise tagajärjeks võib olla see, et signaal on nõrk või puudub. Blokeerimisel võib kasutada ükskõik missugust valku, mis ei seondu huvialuse valgu epitoobiga ega immunofluorestsentsil kasutatavate antikehadega. Sagedasti kasutatakse normaalse seerumi valke, mis on toodetud samas loomaliigis, milles kasutatav sekundaarne antikeha. Levinud on ka valgupuhvrite, näiteks [[veise seerumi albumiin]]i (BSA) ning rasvavaba piimalahuse kasutamine. <ref>[https://bitesizebio.com/13466/immunohistochemistry-basics-blocking-non-specific-staining/ Immunohistochemistry Basics: Blocking Non-Specific Staining] Bitesize Bio koduleht 27.10.2017</ref>
== Immunoreaktsioon ==
| |||