Kasutaja:Ivarik/liivakast: erinevus redaktsioonide vahel
Eemaldatud sisu Lisatud sisu
Resümee puudub |
Resümee puudub |
||
10. rida:
== Fikseerimine ==
Fikseerimine on immunofluorestsentsi protokolli kõige esimene etapp. Fikseerimise eesmärgiks on säilitada rakke, rakulisi moodustisi või [[kude]]t oma hetkelises seisukorras. Fikseerimise juures on oluline see, et rakulised struktuurid jääksid oma natiivsesse vormi nii kauaks kui võimalik. Immunofluorestsentsil kasutatakse mitmeid erinevaid fikseerimise meetodeid ning need võivad primaarse antikeha [[epitoop|epitoobile]] erinevalt mõjuda. Antikeha seondumiskohad võivad fikseerimise tagajärjel maskeeruda või kahjustuda ning see nõrgendab immunofluorestsentsi kvaliteeti. Kuna paljud antikehad seonduvad fikseerimisühenditest sõltuvalt erinevalt oma antigeeniga, siis on uue antikeha kasutamisel vaja testida mitmeid erinevaid fikseerimismeetodeid.
Fikseerimisreagente saab jaotada kaheks: keemilised ristsidujad ja orgaanilised lahustid. Keemilised ristsidujad nagu näiteks [[formaldehüüd]] ristseovad valke nende vabade [[funktsionaalrühm|aminorühmade]] kaudu. Enamasti raku [[morfoloogia]] seejuures säilitatakse, kuid antigeenid ristseotakse samuti ning see võib vähendada antikeha seondumist. Orgaanilised lahustid nagu näiteks [[metanool]] ja [[atsetoon]] on vett eemaldava toimega ja sadestavad valkusid, seetõttu fikseerides neid rakulises kontekstis. Sellise fikseerimise puhul aga kaotatakse palju rakus leiduvaid lahustuvaid ühendeid ning [[lipiid]]seid komponente. Tihti kasutatakse metanooli ja atsetooni koos, sest kuigi metanool on parim vahend rakuliste struktuuride säilitamiseks, on tal kahjustav efekt paljudele epitoopidele. Kui primaarse antikeha tootja pole ühtegi fikseerimise meetodit soovitanud, siis enamikule [[rakuliin]]idele ja antigeenidele sobib 4% formaldehüüdi lahus 10 minuti jooksul toatemperatuuril. <ref name="Florian Hoff"/>
== Permeabiliseerimine ==
16. rida:
== Blokeerimine ==
Blokeerimine on vajalik mittespetsiifilise värvimise takistamiseks ehk selleks, et antikehad ei seonduks millegi muuga kui vaid oma antigeeniga. Ebapiisava blokeerimise tõttu võib tulemuste analüüsimisel olla liiga palju segavat taustamüra ning ülemäärase blokeerimise tagajärjeks võib olla see, et signaal on nõrk või puudub. Blokeerimisel võib kasutada ükskõik missugust valku, mis ei seondu huvialuse valgu epitoobiga ega immunofluorestsentsil kasutatavate antikehadega. Sagedasti kasutatakse normaalse seerumi valke, mis on toodetud samas loomaliigis, milles kasutatav sekundaarne antikeha. Levinud on ka valgupuhvrite, näiteks [[veise seerumi
== Viited ==
| |||