Polümeraasi ahelreaktsioon: erinevus redaktsioonide vahel
Eemaldatud sisu Lisatud sisu
Resümee puudub |
|||
1. rida:
[[Image:PCR tubes.png|thumb|300px|8 PCR tüüpi, igaühes on 100 μl]]
'''Polümeraasi ahelreaktsioon''' ehk '''PCR''' (lühend ingliskeelsest vastest '''''p'''olymerase '''c'''hain '''r'''eaction'') on meetod [[DNA]] või [[RNA]] järjestuse amplifikatsiooniks ehk kordistamiseks. PCR-meetod võimaldab väga väikesest DNA lõigust luua miljoneid koopiaid.
PCR metoodika töötas 1983. aastal välja [[Kary Mullis]], kes 1993. aastal sai koos [[Michael Smith]]iga selle eest Nobeli keemiaauhinna. <ref name="Kary Mullis Nobel Lecture" />
[[Image:PCR.svg|thumb|right|300px| Joonis PCR tsüklist. '''(1) Denatureerimine 94–96 °C (2) Seondumine ~65 °C (3) Süntees 72 °C'''.]]
PCR metoodika võimaldab ''[[in vitro]]'' paljundada konkreetset DNA fragmenti, kasutades selleks termostabiilset [[DNA polümeraas]]i. Esimene termostabiilne DNA polümeraas ([[Taq polümeraas]]), mida kasutati PCR-i läbiviimiseks, isoleeriti termofiilsest bakterist ''[[Thermus aquaticus]]''. Taq polümeraas on monosubühikuline ensüüm, millel puudub replikatsioonivigu parandav 3’-5’eksonukleaasne aktiivsus. Seetõttu on Taq polümeraasi poolt läbiviidav DNA süntees küllaltki vigaderohke. Selleks, et amplifitseerida kindlat DNA järjestust, peab vähemalt osaliselt teadma uuritava DNA nukleotiidset järjestust. Uuritava DNA regiooniga külgnevatele järjestustele sünteesitakse komplementaarselt kaks lühikest, üksikahelalist DNA fragmenti ehk [[praimer]]it, millest üks on komplementaarne kodeeriva ahelaga, teine matriitsahelaga.<ref name="a" />
==PCR-i põhimõte==
20. rida:
'''3. DNA süntees.'''
Kui praimerid on amplifitseeritava DNA järjestuse kahelt poolt kindlaks teinud ja piiranud, sünteesib termostabiilne DNA polümeraas praimerite 3’ otsast alates mõlemale DNA üksikahela fragmendile komplementaarse fragmendi, kasutades selleks segusse lisatud nukleotiide. Protseduur toimub 72 °C juures ning selleks kasutatakse termostabiilset Taq polümeraasi.<ref name="b" />
Neid tsükleid korratakse 20–30 korda, et amplifitseerida piisav arv DNA molekule.
34. rida:
'''[[Termotsükler]]''' ehk PCR-masin on polümeraas ahelreaktsiooniks vajalik aparatuur, mis sisaldab reaktsioonituubide hoidjat ja programmi, mis automatiseerib tuubide aluse kuumutamise kindlal temperatuuril kindla ajavahemike kaupa. Tänapäevaks on loodud PCR-masinad, mis detekteerivad amplikonide tekkimist reaalajas ning suudavad analüüsida [[mRNA]] pealt sünteesitud DNA kogust ja geenide ekspressiooni taset. See kõik on võimalik fluorestseeruvate märgiste abil, mille olemasolu
detekteeritakse [[fotodetektor]]itega, mis on ühenduses PCR masinaga. PCR reaktsioone võib olla erinevaid ning selle tagab temperatuuri, praimerite kasutuse, tsüklite ja reaktsiooni arvu muutmise võimalus.<ref name="f" />
==PCR-saaduste analüüs==
46. rida:
Samuti ei ole PCR-i puhul DNA puhtus nii oluline kui klassikalise analüüsi korral. [[Restriktaas]]e, mille tööd DNA saastatus mõjutada võib, ei kasutata ning elektroforeesifragmendid on PCR-i käigus juba sünteesitud ja seega lisaaineteta.
Puuduseks on esiteks vajadus teada DNA täpseid järjestusi, mille alusel sünteesida praimerid. Lisaks ka asjaolu, et piirkonnad on lühikesed, mistõttu näiteks isikute tuvastamisel või isadustestis on juhuslik kokkulangevus tõenäolisem. DNA sünteesimise käigus võib tekkida ka vigu, sest ei ole vajalikke kontrollmehhanisme, mis eksisteerivad loodusliku [[replikatsioon]]i puhul.<ref name="c" />
==PCR-i kasutusalad==
54. rida:
PCR-i saab kasutada ka [[preimplantatsioon]]-diagnostiliselt näiteks [[tsüstiline fibroos|tsüstilise fibroosi]] tuvastamiseks. Testimiseks isoleeritakse ''in vitro'' tekkinud kaheksarakulisest [[embrüo]]st üks rakk. Sellest ekstraheeritakse DNA ning amplifitseeritakse praimeritega piiritletud fragmenti (tsüstilist fibroosi põhjustav järjestus DNA-s on teada). Saadud fragmente analüüsitakse elektrofereesil. Implatsiooniks kasutatakse vaid haigusevaba embrüot.
PCR aitab identifitseerida kultiveerimatuid või aeglaselt kasvavaid mikroorganisme, nagu näiteks [[mükobakter]]eid või [[anaeroob]]seid baktereid, keda on laboritingimustes keeruline kasvatada.<ref name="d" />
PCR-i kasutatakse alates analüüsi ja sellega seotud meetodite väljatöötamisest kuni tänapäevani ja edaspidigi:
66. rida:
d) uute ravimite väljatöötamisel ning laboratoorsetel ning kliinilstel katsetel jne.
*kriminalistikas
*[[evolutsioonibioloogia]]s [[fülogeneetika]] uurimisel, elusorganismide fülogeneesi ja ontogenessi komplekteerimisel;
*[[zooloogia]]s imetajate ning kahepaiksete jt põlvnemise ning arenguga ja haigustega seonduvat (vahest ka käitumist) uurides;
*[[ökoloogia]]s
==Vaata ka==
89. rida:
==Viited==
{{
<ref name="a">[http://en.wikipedia.org/wiki/PCR<], Inglise keelne Vikipeedia artikkel.</ref>
<ref name="Kary Mullis Nobel Lecture">[http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/mullis-lecture.html Kary Mullis Nobel Lecture, December 8, 1993]</ref>
<ref name="b">[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7571/#A552], Human Molecular Genetics. 2nd edition. Strachan T, Read AP.New York: Wiley-Liss; 1999, Chapter 6.1.1.</ref>
<ref name="f">[http://advan.physiology.org/content/29/3/151.full],The power of real-time PCR ,Valasek, A. M. Repa,(2005)</ref>
<ref name="c">[http://www.ut.ee/biodida/eibe/pdf/Unit02EN.pdf], European Initiative for Biotechnology Education; 1998,Chapter DNA profiling</ref>
<ref name="d">[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7571/#A580], Human Molecular Genetics. 2nd edition. Strachan T, Read AP.New York: Wiley-Liss; 1999, Chapter 6.2.</ref>
<ref name="u">[http://advan.physiology.org/content/28/2/44.full],The polymerase chain reaction,Powledge, M. T. (2004)</ref>
}}
| |||