Polümeraasi ahelreaktsioon: erinevus redaktsioonide vahel
Eemaldatud sisu Lisatud sisu
Resümee puudub |
Resümee puudub |
||
1. rida:
{{Koolitöö|14. novembril 2011|kool=TÜ loodus- ja tehnoloogiateaduskond}}
[[Image:PCR tubes.png|thumb|300px|
==Polümeraasi ahelreaktsioon ehk PCR==
'''Polümeraasi ahelreaktsioon''' ehk '''PCR''' (akronüüm inglise keelsest vastest '''''p'''olymerase '''c'''hain '''r'''eaction'') on meetod [[DNA]] või [[RNA]] järjestuse [[amplifikatsiooniks]] ehk kordistamiseks. PCR-meetod võimaldab väga väikesest DNA lõigust luua miljoneid koopiaid.
PCR metoodika töötas 1983.aastal välja Kary Mullis, kes sai selle eest keemias Nobeli preemia 1993.aastal koos Michael Smithiga. <ref name="Kary Mullis Nobel Lecture"/>
PCR metoodika võimaldab ''in vitro'' paljundada konkreetset DNA fragmenti, kasutades selleks termostabiilset DNA polümeraasi. Esimene termostabiilne DNA polümeraas (Taq polümeraas), mida kasutati PCR läbiviimiseks, isoleeriti termofiilsest bakterist ''Thermus aquaticus''. Taq polümeraas on monosubüflaboruhikuline ensüüm, millel puudub replikatsioonivigu parandav 3’-5’eksonukleaasne aktiivsus. Seetõttu on Taq polümeraasi poolt läbiviidav DNA süntees küllaltki vigaderohke. Selleks, et amplifitseerida kindlat DNA järjestust, peab vähemalt osaliselt teadma uuritava DNA nukleotiidset järjestust. Uuritava DNA regiooniga külgnevatele järjestustele sünteesitakse komplementaarselt kaks lühikest, üksikahelalist DNA fragmenti ehk praimerit, millest üks on komplementaarne kodeeriva ahelaga, teine matriitsahelaga.<ref name="a"/>▼
[[Image:PCR.svg|thumb|right|300px| Joonis PCR tsüklist. '''(1) Denatureerimine 94–96 °C (2) Seondumine ~65 °C (3) Süntees 72 °C'''.]]
▲PCR metoodika võimaldab ''in vitro'' paljundada konkreetset DNA fragmenti, kasutades selleks termostabiilset DNA polümeraasi. Esimene termostabiilne DNA polümeraas (Taq polümeraas), mida kasutati PCR läbiviimiseks, isoleeriti termofiilsest bakterist ''Thermus aquaticus''. Taq polümeraas on monosubüflaboruhikuline ensüüm, millel puudub replikatsioonivigu parandav 3’-5’eksonukleaasne aktiivsus. Seetõttu on Taq polümeraasi poolt läbiviidav DNA süntees küllaltki vigaderohke. Selleks, et amplifitseerida kindlat DNA järjestust, peab vähemalt osaliselt teadma uuritava DNA nukleotiidset järjestust. Uuritava DNA regiooniga külgnevatele järjestustele sünteesitakse komplementaarselt kaks lühikest, üksikahelalist DNA fragmenti ehk praimerit, millest üks on komplementaarne kodeeriva ahelaga, teine matriitsahelaga.<ref name="a"/>
==PCR põhimõte==
33. rida:
DNA sünteesi kiiruseks arvestatakse PCR programmis keskmiselt 1000 aluspaari minutis. Teise PCR tsükliga tekib kaks DNA molekuli, mille ühes otsas on märklaudjärjestuse pikkused ja teises otsas 3 üleulatuvat üksikahelalist ala. PCR kolmandas tsüklis tekib DNA fragmente, mis sisaldavad ainult märklaudjärjestusi. Selliste DNA fragmentide osakaal hakkab järgnevate tsüklite jooksul eksponentsiaalselt kasvama, jõudes 30 tsükli järel molekulini. Pikemate PCR fragmentide hulk on 30 tsükli lõppedes vaid 60 molekuli. See arvutuskäik on teoreetiline ja kehtib vaid juhul, kui PCR reaktsioon on alustatud ühe DNA molekuliga ja kui DNA polümeraasi reaktsioon iga PCR tsükli jooksul on täielikult toimunud.
[[Image:Pcr machine.jpg|thumb|200px|'''
==PCR masin ehk termotsükler==
| |||