Polümeraasi ahelreaktsioon: erinevus redaktsioonide vahel

'''Polümeraasi ahelreaktsioon''' ehk '''PCR''' (akronüüm inglise keelsest vastest '''''p'''olymerase '''c'''hain '''r'''eaction'') on meetod [[DNA]] või [[RNA]] järjestuse [[amplifikatsiooniks]] ehk kordistamiseks. PCR-meetod võimaldab väga väiksestväikesest DNA lõigust luua miljoneid koopiaid.

PCR metoodika võimaldab ''in vitro'' paljundada konkreetset DNA fragmenti, kasutades selleks termostabiilset DNA polümeraasi. Esimene termostabiilne DNA polümeraas (Taq polümeraas), mida kasutati PCR läbiviimiseks, isoleeriti termofiilsest bakterist ''Thermus aquaticus''. Taq polümeraas on monosubühikulinemonosubüflaboruhikuline ensüüm, millel puudub replikatsioonivigu parandav 3’-5’eksonukleaasne aktiivsus. Seetõttu on Taq polümeraasi poolt läbiviidav DNA süntees küllaltki vigaderohke. Selleks, et amplifitseerida kindlat DNA järjestust, peab vähemalt osaliselt teadma uuritava DNA nukleotiidset järjestust. Uuritava DNA regiooniga külgnevatele järjestustele sünteesitakse komplementaarselt kaks lühikest, üksikahelalist DNA fragmenti ehk praimerit, millest üks on komplementaarne kodeeriva ahelaga, teine matriitsahelaga.<ref name="testa"/>

'''PCR reaktsioonireaktsioon toimub kolme-etapiliselt''':

'''1).DNA ahelate denatureerimine.'''

Kui DNA on rakust eraldatud ja puhastatud, võib alustada PCR analüüsiga. PCR-i puhul on kindlatel juhtudel võimalik kasutada ka puhastamata DNA-d, kuid see on ebaefektiivsem variantebaefektiivne. DNA denatureerimiseks kuumutatakse sedaDNA-d 90–95 °C juures, kusmille käigus DNA biheeliks laguneb kaheks üksikahelaks. See on vajalik huvipakkuvate fragmentide paljundamiseks. Süntees saab toimuda vaid üksikahelalt.

DNA denatureerumine toimub järskude etappidena väga kindlatel temperatuuridel. DNA denatureerimistemperatuuri nimetatakse DNA sulamistemperatuuriks. Mida kõrgem on G-C paaride sisaldus võrreldes A-T paaridega võrreldes, seda kõrgem on sulamistemperatuur.

PCR-i puhul on vaja teada lühikesi järjestusi kahel pool sünteesitavat piirkonda. Külgnevate järjestuste järgi on sünteesitud komplementaarsed praimerid. Tavaliselt 15–25 nukleotiidi pikkused oligonukleotiidid. Nende seondumine DNA-ga on vajalik seetõttu, etkuna alad, kuhu praimerid kinnituvad, on fragmentide sünteesi initsiaatoriteks. Praimerid seonduvad komplementaarsusprintsiibi alusel mõlemale poole piirkonda.

'''2).Praimerite seondumine DNA ahelatega.'''

Praimerite seondumine ehk ''annealing'' toimub 50–70 °C juures. Selleks, et kinnitustemperatuur mõistlik oleks, tulebki praimerid teha 20 nukleotiidi pikkused,. Sellisel siisjuhul ongi nende sulamistemperatuur vajalikus vahemikus. Praimerite G-C sisaldus on ka oluline. See-see peaks jääma 50–55% ulatusse., Väiksemaväiksema sisalduse korral tuleb praimeritpraimereid pikendada.

'''3).DNA süntees.'''

Kui praimerid on amplifitseeritava DNA järjestuse kahelt poolt määratlenudkindlaks teinud ja piiranud, sünteesib termostabiilne DNA polümeraas praimerite 3’ otsast alates mõlemale DNA üksikahela fragmendile komplementaarse fragmendi, kasutades selleks segusse lisatud nukleotiide. Protseduur toimub 72 °C juures ning selleks kasutatakse termostabiilset Taq polümeraasi.<ref>b</ref>

Juhul kui amplifitseeritakse otse rakkudest pärit DNA-d või kui kasutavakasutatava DNA polümeraasi aktivatsiooniks on vajalik eelnev temperatuuri tõstmine, eelkuumutatakse PCR segu ligikaudu 10 minutit 96 °C juures.

Samuti on soovitatav kasutada pärast PCR tsüklite lõpetamist lisa DNA sünteesi etappi 10 minutit 72 °C juures 10 minutit. Lisasüntees on vajalik selleks, et Taq DNA polümeraas saaks lõpuni sünteesida kõik seni DNA sünteesil üksikahelaliseks jäänud DNA otsad.

DNA sünteesi kiiruseks arvestatakse PCR programmis keskmiselkeskmiselt 1000 aluspaari minutis. Teise PCR tsükliga tekib kaks DNA molekuli, mille ühestühes otsastotsas on märklaudjärjestuse pikkused ja teisestteises otsastotsas omavad3 3’-üleulatuvat üksikahelalist ala. PCR kolmandas tsüklis tekib DNA fragmente, mis sisaldavad ainult märklaudjärjestusi. Selliste DNA fragmentide osakaal hakkab järgnevate tsüklite jooksul eksponentsaalselteksponentsiaalselt kasvama, jõudes 30 tsükklitsükli järel 1 073 741 766 DNA molekulini. Pikemate PCR fragmentide hulk on 30 tsükli lõppedes vaid 60 molekuli. See arvutuskäik on teoreetiline ja kehtib vaid juhul, kui PCR reaktsioon on alustatud ühe DNA molekuliga ja kui DNA polümeraasi reaktsioon iga PCR tsükli jooksul on toimunud täielikult toimunud.

Amplifitseeritud piirkondade pikkust määratakse, nagu klassikalise DNA analüüsi puhulgi, geelelektroforeesil. PCR produktid kantakse geeli kaevudesse ning eraldi foreesirajale pikkusmarker (juba teadaoleva pikkusega DNA lõik). Forees viiakse läbi 150 V150V juures 30 minuti vältel. PCR produktid visualiseeritakse arvuti poolt juhitud laseritega ning tulemused esitatakse graafikuna.

Üheks PCR meetodi eeliseks on selle kiirus ja kasutamise lihtsus. Ühe fragmendi amplifitseerimiseks piisavas koguses kulub vaid 2–3 tundi ning lihtsuse tagab protseduuri automatiseeritus. Kiirust lisab ka see, et ühe PCR protseduuri käigus on erinevates tuubides võimalik korraga töödelda 4–6 erinevat piirkonda. Tähtsaks eeliseks on PCR analüüsi suur tundlikkus- kui klassikalise DNA analüüsi jaoks läheb vaja vähemalt 20 ng20ng puhastatud DNA-d, piisab PCR-i puhul ühest nanogrammist ning protseduur võib õnnestuda isegi õnnestuda vaid ühe raku olemasolul.

Samuti ei ole PCR-i puhul DNA puhtus nii oluline kui klassikalise analüüsi korral. Restriktaase, mille tööd DNA saastatus mõjutada võib, ei kasutata ning elektroforeesifragmendid on PCR-i käigus juba sünteesitud ja seega lisaaineteta.

Puuduseks on esiteks vajadus teada DNA täpseid järjestusi, mille alusel sünteesida praimerid. Lisaks ka asjaolu, et piirkonnad on lühikesed, mistõttu näiteks isikute tuvastamisel või isadustestis on juhuslik kokkulangevus tõenäolisem. DNA sünteesimise käigus võib tekkida ka vigu, sest ei ole vajalikke kontrollmehhanisme, mis eksisteerivad loodusliku replikatsiooni puhul.<ref>c</ref>

PCR aitab identifitseerida kultiveerimatuid või aeglaselt kasvavaid mikroorganisme nagu näiteks mükobaktereid või anaeroobseid baktereid, keda on labori tingimusteslaboritingimustes keeruline kasvatada.<ref>d</ref>

<ref name="testa">[http://en.wikipedia.org/wiki/PCR<], Inglise keelene Vikipeedia artikkel.</ref>