Erinevus lehekülje "Transformatsioon (geneetika)" redaktsioonide vahel

resümee puudub
P
Siiski oldi üsna veendunud, et [[Escherichia coli]] ei ole transformatsioonialdis. Alles aastal 1970 näitasid [[Morton Mandel]] ja [[Akiko Higa]] <ref>[Mandel, Morton; Higa, Akiko (1970). "Calcium-dependent bacteriophage DNA infection". Journal of Molecular Biology 53 (1): 159–162. doi:10.1016/0022-2836(70)90051-3. PMID 4922220].</ref>, et [[kaltsiumkloriid]]i lahusega töötlemise tagajärjel on E. coli võimeline väliskeskkonnast ilma faagi abita bakteriofaagi DNA-d inkorporeerima. Paar aastat hiljem tõestasid Stanley Cohen, Annie Chang ja Leslie Hsu, <ref>[Cohen, Stanley; Chang, Annie and Hsu, Leslie (1972). "Nonchromosomal Antibiotic Resistance in Bacteria: Genetic Transformation of Escherichia coli by R-Factor DNA". Proceedings of the National Academy of Sciences 69 (8): 2110–4. doi:10.1073/pnas.69.8.2110. PMC 426879. PMID 4559594].</ref> et sarnane meetod on efektiivne ka [[plasmiid]]se DNA puhul. Mandeli ja Higa meetodit arendas hiljem edasi [[Douglas Hanahan]]. <ref>[Hanahan, D. (1983). "Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids". Journal of molecular biology 166 (4): 557–580. doi:10.1016/S0022-2836(83)80284-8. PMID 6345791].</ref> Kunstlikult tekitatud kompetentsuse võimalikkus E. coli kui laialdaselt kasutatava [[mudelorganism]]i puhul pani aluse mugava ja efektiivse metoodika arendamisele bakterite transformeerimiseks, mis võimaldab [[biotehnoloogia]]s ja teadustöös kasutada varasemast oluliselt lihtsamaid molekulaarse [[kloneerimine|kloneerimise]] võtteid. Praeguseks on transformatsiooni näol tegu igapäevase laboriprotseduuriga.
Transformatsioon [[elektroporatsioon]]i teel arendati välja 1980. aastate lõpul, tuues kaasa [[in-vitro]] transformatsiooni efektiivsuse tõusu ja võimaluse enamate bakteritüvede transformatsiooniks.<ref>[Wirth, Reinhard; Friesenegger, Anita and Fiedlerand, Stefan (1989). "Transformation of various species of gram-negative bacteria belonging to 11 different genera by electroporation"].</ref> Molecular and General Genetics MGG. Uuriti ka taime- ja loomarakkude transformeerimise võimalusi, mis päädis esimese [[transgeenne|transgeense]] hiire loomisega aastal 1982, süstides hiire [[embrüo|embrüosse]] geeni roti kasvuhormooni jaoks. <ref>[Palmiter, Richard; Ralph L. Brinster, Robert E. Hammer, Myrna E. Trumbauer, Michael G. Rosenfeld, Neal C. Birnberg & Ronald M. Evans (1982). "Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein−growth hormone fusion genes". Nature 300 (5893): 611–5. doi:10.1038/300611a0. PMID 6958982].</ref> Varajastel 1970. aastatel avastati, et Ti-plasmiid [[Agrobacterium tumefaciens]]i rakkudes on põhjuseks, miks antud bakter taimedele kasvajaid tekitab. <ref>[Nester, Eugene. "Agrobacterium: The Natural Genetic Engineer (100 Years Later)". Retrieved 14 January 2011].</ref> [[Ti-plasmiid]] integreerub taime [[genoom]]i <ref>[Zambryski, P.; Joos, H.; Genetello, C.; Leemans, J.; Montagu, M. V.; Schell, J. (1983). "Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity". The EMBO journal 2 (12): 2143–2150. PMC 555426. PMID 16453482].</ref> , kutsudes esile tuumorite teket. Asendades Ti-plasmiidis kasvajat tekitava geeni mõne muu huvipakkuva [[geen]]iga, on võimalik A. tumefaciensiga taimi nakatades [[kaheiduleheline|kaheiduleheliste]] taimede genoomi viia valitud DNA. [[Üheiduleheline|Üheiduleheliste]] ja mõningate teiste A. tumefaciensi suhtes tundetute taimede transformatsiooniks kasutatakse elektroporeerimist ning [[mikro-injektsioon]]i <ref>[Peters, Pamela. "Transforming Plants – Basic Genetic Engineering Techniques". Retrieved 28 January 2010].</ref> [[Biolistiline|Biolistilise]] meetodi ehk raku pommitamise geneetilise materjaliga kaetud metalliioonidega võttis 1990 aastal kasutusele [[John Stanford]]. <ref>[Voiland, Michael; McCandless, Linda. "DEVELOPMENT OF THE "GENE GUN" AT CORNELL". Retrieved 28th january 2010.].</ref>
 
 
Lihtsaim neist on transformatsioon Agrobacterium tumefaciensi abil. Selleks lõigatakse taime kude, milleks tavaliselt on [[leht]], väikesteks tükkideks ja leotatakse umbes kümme minutit Agrobacteriumi sisaldavas [[suspensioon]]is. Servmised rakud, mis asuvad lõikepinnal, saavad bakteri poolt transformeeritud. Kui selliselt töödeldud koetükid juurdumise ja võrsekasvu suhtes selektiivsel söötmel üles kasvatada, saadakse geneetiliselt teisenenud taimed. Mõnede taimeliikide puhul piisab ka sellest, kui nende õis bakterisuspensiooni kasta ja hiljem seemned selektiivsele söötmele külvata. Paljusid taimeliike antud meetodiga siiski modifitseerida ei saa. Väga suur osa taimedes on transformeeritavad kulla- või volframiosakestega pommitamise teel. Selleks kaetakse metalliosakesed DNA-ga ning tulistatakse noortesse taimerakkudesse või taimeembrüosse. Efektiivsus on sel meetodil küll madalam kui Agrobacteriumi kasutades, kuid võimalike mõjustatavate taimede valik on oluliselt laiem. Samuti on suureks eeliseks see, et nii saab transformeerida ka taime plastiide. Kolmandaks võimaluseks on taimerakkude elektroporatsion, mis toimib sarnaselt bakterite puhul kirjeldatule.
 
Geneetilist materjali on võimalik taimerakkudesse viia ka mitmete [[viirus|taimeviiruste]] abil, kuid see pole transformatsioon, vaid [[transduktsioon]] – rakku viidav info on pakitud viiruskapslisse. Kuna suurem osa taimeviirustest on ssRNA-viirused, kelle pärilik materjal tsütoplasmas replitseerub, siis enamasti saab sel moel mõjustada vaid üht põlvkonda rakke. Nakatatud taime järglased ei ole viirusega nakatunud ega kanna endas sisestet geeni. DNA-viirused seevastu on võimelised kromosoomidega [[rekombinatsioon|rekombineeruma]], tekitades taime genoomis püsivaid muutusi, mistõttu kandub selline ümberkorraldus üle ka järglastele.
 
===Loomad===
mudelorganismiks on Escherichia coli, keda enamasti plasmiididega transformeeritakse. Plasmiidsel DNA-l peab rakku püsimajäämiseks olema oma [[replikatsiooni alguspunkt]], et teda genoomist sõltumatult paljundada saaks. Transformatsiooniefektiivsuse ehk tõhususe, millega töödeldud bakterid väliskeskkonnast DNA-d üles korjavad, mõõtühikuks on CFU/μg DNA kohta.
 
[[CFU]] ehk colony forming unit väljendab eluvõimeliste rakkude hulka näites milliliitris lahuses. Väikese plasmiidi, nagu pUC19, puhul tähendab transformatsiooniefektiivsus 1×10<sup>8</sup> cfu/μg seda, et umbes 1 plasmiid 2000 hulgast läheb rakku sisse.
Keemiliste kompetentide puhul hoitakse rakke jää peal külmas CaCl<sub>2</sub> lahuses, muutes rakud plasmiidsele DNA-le läbitavaks. Rakke inkubeeritakse jääl plasmiidi juuresolekul ja seejärel kuumutatakse 42 °C juures sõltuvalt metoodikast 30–120 sekundit. Mittetööstuslikud meetodid annavad tulemuseks
keskmiselt 10<sup>6</sup>–10<sup>7</sup> transformanti mikrogrammi plasmiidi kohta. Keemiline meetod toimib rõngasja DNA puhul väga hästi, kuid ei kõlba lineaarsete DNA fragmentide tarvis, arvatavasti seetõttu, et raku eksonukleaasid lagundavad lineaarse DNA kiiresti ära. Looduslikud kompetendid seevastu transformeeruvad lineaarse DNA-ga paremini kui plasmiidsega.
Anonüümne kasutaja