Erinevus lehekülje "Transformatsioon (geneetika)" redaktsioonide vahel

resümee puudub
Umbes 1% bakteriliikidest on loomulikult kompetentsed, olles võimelised laborikeskkonnas ilma lisatöötluseta vaba DNA-d oma rakku võtma.
On alust arvata, et looduslikus keskkonnas on see protsent suurem. Kui DNA kandub yle yhelt bakterityvelt teisele, nimetatakse seda
[[horizontalhoristontaalne gene transfergeeniülekanne|horisontaalseks geeniylekandeks]], mis on geneetilise materjali saamine teiselt organismilt, olemata selle järglane. <ref> [http://en.wikipedia.org/wiki/Horizontal_gene_transfer Horisontaalne geeniylekanne].</ref> Lähedaste liikide vahel toimib transformatsioon paremini kui evolutsiooniliselt kaugemate liikide puhul. Looduslikult kompetentsetes bakterites on olemas geenikomplektid, mis kodeerivad DNA transmembraanseks transpordiks vajalikke valke, näiteks [[DNA translokaasitranslokaas]]i komplekse tsytoplasmamembraanis <ref>[Chen I, Dubnau D (2004). "DNA uptake during bacterial transformation". Nat. Rev. Microbiol. 2 (3): 241–9. doi:10.1038/nrmicro844. PMID 15083159].</ref> ja tyyp IV kiudude kokkupanekuks tarvilikke valke.
 
Tulenevalt [[Gram-positiivsed bakterid|Gram-positiivsete]] ja [[Gram-negatiivsed bakterid|Gram-negatiivsete]] bakterite rakumembraani erinevustest esineb mõningaid erinevusi viisis, kuidas täpselt bakterid rakuvälist DNA-d enda sisse toovad, kuid yldjoontes on protsess siiski sarnane. Esmalt seondub DNA kompetentse raku pinnal paiknevale DNA retseptorile ning liigub DNA translokaasi abil läbi rakumembraani. <ref>[Lacks, S.; Greenberg, B.; Neuberger, M. (1974). "Role of a Deoxyribonuclease in the Genetic Transformation of Diplococcus pneumoniae". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 71 (6): 2305–2309. PMC 388441. PMID 4152205].</ref> Selle käigus lagundatakse selle yks ahel nukleaaside poolt, kuna rakku pääseb vaid yheahelaline DNA. Sellist yheahelalist DNA-d on RecA ehk [[rekombinaas A]] abil võimalik genoomi integreerida. Gram-negatiivsed bakterid vajavad oma rakukesta mitmekihilise ehituse tõttu valgulist kanalit ka välisesse membraani, mille moodustavad sekretiinid. Arvatakse ka, et oma roll on [[piliin]]il, kuid selle funktsiooni kohta pole veel kuigi palju teada. <ref>[Long, C. D.; Tobiason, D. M.; Lazio, M. P.; Kline, K. A.; Seifert, H. S. (2003). "Low-Level Pilin Expression Allows for Substantial DNA Transformation Competence in Neisseria gonorrhoeae". Infection and immunity 71 (11): 6279–6291. PMC 219589. PMID 14573647].</ref> DNA transport rakku pole enamasti järjestuse-spetsiifiline, ent mõnede
Tulenevalt Gram-positiivsete ja Gram-negatiivsete bakterite rakukesta erinevustest esineb mõningaid erinevusi viisis, kuidas täpselt bakterid
rakuvälist DNA-d enda sisse toovad, kuid yldjoontes on protsess siiski sarnane. Esmalt seondub DNA kompetentse raku pinnal paiknevale DNA
retseptorile ning liigub DNA translokaasi abil läbi rakumembraani. <ref>[Lacks, S.; Greenberg, B.; Neuberger, M. (1974). "Role of a Deoxyribonuclease in the Genetic Transformation of Diplococcus pneumoniae". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 71 (6): 2305–2309. PMC 388441. PMID 4152205].</ref> Selle käigus lagundatakse selle yks ahel nukleaaside poolt, kuna rakku
pääseb vaid yheahelaline DNA. Sellist yheahelalist DNA-d on RecA ehk rekombinaas A abil võimalik genoomi integreerida. Gram-negatiivsed bakterid
vajavad oma rakukesta mitmekihilise ehituse tõttu valgulist kanalit ka välisesse membraani, mille moodustavad sekretiinid. Arvatakse ka, et oma roll
on piliinil, kuid selle funktsiooni kohta pole veel kuigi palju teada. <ref>[Long, C. D.; Tobiason, D. M.; Lazio, M. P.; Kline, K. A.; Seifert, H. S. (2003). "Low-Level Pilin Expression Allows for Substantial DNA Transformation Competence in Neisseria gonorrhoeae". Infection and immunity 71 (11): 6279–6291. PMC 219589. PMID 14573647].</ref> DNA transport rakku pole enamasti järjestuse-spetsiifiline, ent mõnede
liikide puhul võivad kindlad järjestused rakuvälises DNA-s seda kergendada. <ref>[Sisco, K. L.; Smith, H. O. (1979). "Sequence-specific DNA uptake in Haemophilus transformation". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 76 (2): 972–976. PMC 383110. PMID 311478. editFull text at PMC: / 383110].</ref>
 
Elektroporatsiooni käigus antakse bakterirakkude lahusele, kuhu on lisatud soovitav plasmiid, elektrilöök, mis perforeerib nende rakuseina, et plasmiidne DNA siseneda saaks. Peale elektriväljale eksponeerimist parandavad raku membraaniparandusmehhanismid augud taas väledasti ära. Tegu on rakusõbralikuma meetodiga kui soolalahuse kasutamine, kuna rakud viibivad stressitekitavates tingimustes palju lyhemat aega. Kasutatava elektrivälja tugevus jääb tavaliselt vahemikku 10-20 kV/cm.
Keemilisi kompetente hoitakse mõnda aega jää peal kahevalentsete katioonidega soolalahuses, enamasti on selleks kaltsiumkloriidi lahus, misjärel vapustatakse neid kiire lyhiajalise kuumutamisega. Arvatakse, et soolalahuse positiivsed ioonid[[ioon]]id aitavad bakterikesta negatiivselt laetud pinnamolekule neutraliseerida, muutmaks membraani negatiivselt laetud DNA jaoks paremini läbitavaks. Kuumašokk on vajalik selleks, et tekitada temperatuurierinevus raku sise- ja väliskeskkonnas, mis sunnib DNA läbi kahjustatud membraani rakku sisenema.
===Taimed===
 
DNA viimiseks taimedesse on mitmeid mehhanisme.
Lihtsaim neist on transformatsioon Agrobacterium tumefaciensi abil. Selleks lõigatakse taime kude, milleks tavaliselt on [[leht]], väikesteks tykkideks ja leotatakse umbes kymme minutit Agrobacteriumi sisaldavas suspensioonis[[suspensioon]]is. Servmised rakud, mis asuvad lõikepinnal, saavad bakteri poolt transformeeritud. Kui selliselt töödeldud koetykid juurdumise ja võrsekasvu suhtes selektiivsel söötmel yles kasvatada, saadakse geneetiliselt teisenenud taimed. Mõnede taimeliikide puhul piisab ka sellest, kui nende õis bakterisuspensiooni kasta ja hiljem seemned selektiivsele söötmele kylvata. Paljusid taimeliike antud meetodiga siiski modifitseerida ei saa. Väga suur osa taimedes on transformeeritavad kulla- või volframiosakestega pommitamise teel. Selleks kaetakse metalliosakesed DNA-ga ning tulistatakse noortesse taimerakkudesse või taimeembryosse. Efektiivsus on sel meetodil kyll madalam kui Agrobacteriumi kasutades, kuid võimalike mõjustatavate taimede valik on oluliselt laiem. Samuti on suureks eeliseks see, et nii saab transformeerida ka taime plastiide. Kolmandaks võimaluseks on taimerakkude elektroporatsion, mis toimib sarnaselt bakterite puhul kirjeldatule.
 
Geneetilist materjali on võimalik taimerakkudesse viia ka mitmete [[viirus|taimeviiruste]] abil, kuid see pole transformatsioon vaid [[transduktsioon]] - rakku viidav info on pakitud viiruskapslisse. Kuna suurem osa taimeviirustest on ssRNA-viirused, kelle pärilik materjal tsytoplasmas replitseerub, siis enamasti saab sel moel mõjustada vaid yht põlvkonda rakke. Nakatatud taime järglased ei ole viirusega nakatunud ega kanna endas sisestet geeni. DNA-viirused seevastu on võimelised kromosoomidega [[rekombinatsioon|rekombineeruma]], tekitades taime genoomis pysivaid muutusi, mistõttu kandub selline ymberkorraldus yle ka järglastele.
 
===Loomad===
 
DNA viimist loomsetesse rakkudesse nimetatakse harilikult transfekrsiooniks[[transfektsioon]]iks. Ka sel puhul muudetakse rakusein erinevate võtete abil auklikuks, et soovitud materjal rakku liikuda saaks. Transfektsioon ei tähenda ainult DNA viimist rakku, selleks võib olla näiteks siRNA konstrukt või valk nagu antikeha. Transfekteerimiseks kasutatakse kaltsiumfosfaati, elektroporatsiooni või segatakse rakku viidav aine katioonsete lipiididega, moodustamaks liposoome, mis membraaniga kokku sulades sisaldise rakku viivad.
 
 
Kunstliku kompetentsuse tekitamine bakterites annab hea võimaluse DNAga manipuleerimiseks ja valkude ekspressiooniks. Levinuimaks
mudelorganismiks on Escherichia coli, keda enamasti plasmiididega transformeeritakse. Plasmiidsel DNA-l peab rakku pysimajäämiseks olema oma
[[replikatsiooni alguspunkt]], et teda genoomist sõltumatult paljundada saaks.
Transformatsiooniefektiivsuse ehk tõhususe, millega töödeldud bakterid väliskeskkonnast DNA-d yles korjavad, mõõtyhikuks on CFU/μg DNA kohta.
[[CFU]] ehk colony forming unitsunit väljendab eluvõimeliste rakkude hulka näites milliliitris lahuses. Väikese plasmiidi nagu pUC19 puhul tähendab transformatsiooniefektiivsus 1x10<sup>8</sup> cfu/μg seda, et umbes 1 plasmiid 2000 hulgast läheb rakku sisse.
Keemiliste kompetentide puhul hoitakse rakke jää peal kylmas CaCl<sub>2</sub> lahuses, muutes rakud plasmiidsele DNA-le läbitavaks. Rakke inkubeeritakse jääl plasmiidi juuresolekul ja seejärel kuumutatakse 42°C juures sõltuvalt metoodikast 30-120 sekundit. Mittetööstuslikud meetodid annavad tulemuseks
keskmiselt 10<sup>6</sup> - 10<sup>7</sup> transformanti mikrogrammi plasmiidi kohta. Keemiline meetod toimib rõngasja DNA puhul väga hästi, kuid ei kõlba lineaarsete DNA fragmentide tarvis, arvatavasti seetõttu, et raku eksonukleaasid lagundavad lineaarse DNA kiiresti ära. Looduslikud kompetendid seevastu transformeeruvad lineaarse DNA-ga paremini kui plasmiidsega.
Anonüümne kasutaja