Lutsiferaas
Lutsiferaas on ensüüm, mis kiirendab bioluminestsentsi ehk helendamist põhjustavat reaktsiooni. Bioluminestsents tekib lutsiferiini reageerimisel hapnikuga. Reaktsiooniks vajalik energia saadakse ATP-lt ja Ca2+ ioonidelt. Reaktsioon on levinud paljude merelise eluviisiga selgrootutel, selgroogsetel, osadel maismaaloomadel, seentel ja ka mikroorganismidel. Tuntuim näide on jaanimardikas (Lampyris noctiluca). Emane jaaniuss kiirgab oma tagakehal paiknevate helenduselundite abil kollakasrohelist valgust, mis meelitab isaseid.
Näited muuda
Bioluminestsents saavutatakse organismides erinevate reaktsioonide abil. Seetõttu on kujunenud välja erinevaid reaktsioone katalüüsivad lutsiferaasid.[1]
Jaanimardika lutsiferaas ja naksurlased muuda
Jaanimardiklastel esinev lutsiferaas on kõige levinum ensüüm. 61 kDa suuruse ensüümi reaktsioon toimub kahes etapis: ATP aktiveerib lutsiferüül karboksülaadi ja saadav intermediaat (lühiajaline, ebastabiilne molekul) reageerib hapnikuga. Reaktsiooni toimumiseks vajalik Mg2+ olemasolu. Tulemusena saadakse oksülutsiferiin ja süsihappegaas.[2] Oksülutsiferiini lagunemisel vabaneb valgusfooton. Rohekaskollase valguse lainepikkus on 550–570 nm.[3] See lutsiferaas on laialt levinud ka geneetilise reporterina. Lutsiferaasi kodeeriv luc-geen on kohe pärast mRNA translatsiooni ja ribosoomist vabanemist kasutusvalmis. Lisaks on võimalik ligi kolme tunni jooksul ensüümi ka rakkudes tuvastada.[4] Naksurlastesugukonna Pyrophoruse perekonna mõningatel liikidel on võime bioluminestsentsireaktsioonideks. Nende ensüümide abil on võimalik varieeruvaid bioluminestsentsi värve näha.
Renilla lutsiferaas muuda
Merikannul (inglise sea pansy) Renilla reniformis, esineb Renilla lutsiferaas. Tegemist on 36 kDA suuruse ensüümiga. Reaktsiooni käigus oksüdeeritakse koelenterasiin koelenteramiidiks.[4] Lutsiferaas on seotud lutsiferiini siduva proteiiniga ja rohelise fluorestseeruva proteiiniga (inglise green fluorescent protein GFP). Kaltsiumi ja hapniku olemasolul vabaneb koelenterasiin lutsiferiini siduva proteiini küljest, järgneb oksüdatsioon. Reaktsiooni saaduseks on koelenteramiid ja energia vabanemine rohelise valguse footoni kujul.[5]GFP puudumisel vabaneb sinise valguse footon lainepikkusega 480 nm. Renilla lutsiferaas on kodeeritud Rluc-geeni poolt. Geenide regulatsiooni ja funktsiooni uurimiseks on kasutusel lutsiferaasi reportergeenid.[6] Renilla ja jaanimardika lutsiferaasid nõuavad erinevat substraati ja kiirgav valgus on eristatav, see võimaldab ensüümide samaaegset kasutamist.[3]
Gaussia lutsiferaas muuda
Mere aerjalgsel (inglise Marine copepod) Gaussia princeps bioluminestsentsi põhjustab Gaussia lutsiferaas. Tegemist on 19 kDa suuruse ensüümiga, mis katalüüsib oksüdatiivse dekarboksülatsiooni protsessi ehk oksüdatsiooni reaktsiooni, mille käigus eemaldatakse karboksüülhapped ning tekib süsihappegaas. Konkreetse protsessi puhul tekib koelenterasiinist koelenteramiid.[7] Gaussia lutsiferaas vajab substraadina hapnikku ja koelenterasiini, kuid ei sõltu ATP olemasolust.[8] Reaktsiooni ühe saadusena eraldub erksinine valgus lainepikkusega 480 nm. Ensüüm on tänu disulfiidsidemetele kõrgematel temperatuuridel stabiilne. Samuti peab vastu nii aluselise kui happelise pH-ga keskkonnas.[9] GLuc-ensüümi peetakse hetkel väikseima suurusega lutsiferaasiks ja eelnevalt kirjeldatud omaduste tõttu on tegemist väga eduka reportergeenina.[10]
Dinoflagellaadi lutsiferaas muuda
Merelise eluviisiga dinoflagellaadi Lingulodinium polyedrume lutsiferaasi struktuur on unikaalne. See koosneb N-terminaalsest domeenist ja kolmest sarnasest 42 kDa suurusest aktiivsest domeenist, mis eelnevad helikaalsetele kimpdomeenidele. Domeen on osa valgu struktuurist, mis on võimeline sõltumata ülejäänud valgust arenema ja funktsioneerima.[11] Need kolm domeeni paiknevad kõik ühes polüpeptiidis. Katalüütiline domeen on 10-ahelaline beeta tünn. Lutsiferaasi ja lutsiferiini siduvate proteiinide (LBP) vahel asub N-terminaalne domeen. Helikaalne kimpdomeen sisaldab kolmest helikaalsest kimbust koosnevat struktuuri. See struktuur võimaldab nelja histidiini hoida, mis omavad rolli ensüümi pH-regulatsioonil.[5] [12] Katalüütilise domeeni sees paikneb avaus, mis võtab vastu tetrapüroolseid substraate. Pürool koosneb neljast süsiniku, ühest lämmastiku ja viiest vesiniku aatomist (C4H5N). pH 8 juures ei saa substraadid konformatsiooni tõttu siseneda. Sisenemiseks vajalik konformatsiooniline muutus.[12] Optimaalse pH 6,3 juures N-terminaalsed hisitidiini jäägid eralduvad, katalüütilise domeeni konformatsioon muutub ja aktiivsait avaneb. Seega pH 8 juures seob LBP lutsiferiini, pH 6,3 põhjustab lutsiferiini vabanemise. Vabanenud lutsiferiin reageerib lutsiferaasiga ja tekib sinine valgussähvatus.[13][5]
Reaktsioonimehhanism muuda
Jaanimardika lutsiferaas on levinuim ensüüm. Reaktsioon toimub kahes etapis:
- Lutsiferiin + ATP → lutsiferüül adenülaat + Ppi
- Lutsiferüül adenülaat + O2 → oksülutsiferiin + AMP + valgus
Adenülaat on AMP sool või ester. Oksülutsiferiin on ergastatud olekus, reaktsiooni käigus vabaneb valgusfooton ja oksülutsiferiin langeb tagasi tavaolekusse. Osa lutsiferüül adenülaadist reageerib hapnikuga. Selle kõrvalreaktsiooni saadusteks on vesinikperoksiid ja dehüdrolutsiferüül-AMP.[5]
Laboratoorseks kasutamiseks vajatakse bioluminestsentset signaali, mis kestaks võimalikult kaua. Seni on parima tulemuse andnud koensüüm A kaasamine. Ilmselt on firefly lutsiferaasi aminohappeline järjestus seotud atsüül-CoA süntetaasi perekonnaga. Katalüütilise reaktsiooni käigus võib tekkida tioolester.[4]
Jaanimardika lutsiferaas on võimeline lutsiferüül-CoA-d sünteesima. Selleks on sobivad tavalise aeroobse lutsiferiin-lutsiferaas reaktsiooni tingimused. Lutsiferiinil on erinevaid struktuure. Lutsiferaas on võimeline neid eristama. Kui atsüül-CoA ja D-lutsiferiini kasutatakse luminestsentsi reaktsioonides, toimib lutsiferaas L-lutsiferiinile. Siiski on ka L-lutsiferiin võimeline nõrka valgust eraldama, sest CoA sünteesi reaktsiooni saadus on esteraasi abil võimalik tagasi D-lutsiferiiniks muuta.[14][15]
Rakendused muuda
Elavate loomade bioloogiliste protsesside mõistmiseks ja uurimiseks otsitakse aina paremaid meetodeid. Lutsiferaasi abil on võimalik geene kaardistada. Seda ensüümi on võimalik geenitehnoloogia abil produtseerida. Lutsiferaasi geenid sünteesitakse ja sisestatakse huvi pakkuvatesse organismidesse. Täpsemalt vaadates on lutsiferaasi geeni sisaldav geneetiline konstrukt huvi pakkuva promootori kontrolli all. Ensüümi aktsiivsust on sel viisil kerge tuvastada. Uue generatsiooni CCD-sensor ehk optoelektriline kiirgusvastuvõtja tuvastab looma kudedes valguse. Footonite kiirgus on tuvastav ka luminomeetri abil. Süsteem on lihtne ja efektiivne meetod, mis võimaldab transfekteeritud (protsess, milles on eukarüootsesse rakku viidud võõras DNA molekul) rakkude promootori aktiivsust uurida. Eriti tõhus on see nõrgalt ekspresseeritud geenide puhul. Levinuim näide on hiired.[16][5][17]
Lutsiferaas võimaldab rakus ATP hulka mõõta. Biotinüülimisel toimib lutsiferaas ATP sensorina. Biotinüülimine aitab siduda lutsiferaasi raku pinnal asuva streptavidiin-biotiini kompleksiga. Lutsiferaas eraldab bioluminestsentsi ATP väljavooluga samaaegselt.[5]
Bakteriaalseid luminestseerivaid süsteeme kasutatakse "Helendava taime projektis" (The Glowing Plant project), et aretada helendavad Arabidopsis thaliana taimed. Suuremas plaanis võivad sellised süsteemid aidata kaasa keskkonnasäästlike valgusallikate loomisele.[18]
Samuti uuritakse temperatuuritundlikke proteiine denaturatsiooni lutsiferaasi abil.[5]
Nimetus muuda
Nimetus "lutsiferaas" tuleb ladina keelest, sõnast lucifer – 'valgusekandja', 'valgusetoojaä.
Viited muuda
- ↑ David Goodsell Molecule of the Month Juuni 2006
- ↑ Jennifer McDowall Firefly Luciferase Juuni 2006
- ↑ 3,0 3,1 What are some of the differences between Renilla luciferase and firefly luciferase?[alaline kõdulink]
- ↑ 4,0 4,1 4,2 Bioluminescent Reporters
- ↑ 5,0 5,1 5,2 5,3 5,4 5,5 5,6 http://en.wikipedia.org/wiki/Luciferase | Luciferase
- ↑ Renilla Luciferase Assay Kit
- ↑ M. Verhaegen, T. K. Christopoulos Recombinant Gaussia Luciferase. Overexpression, Purification, and Analytical Application of a Bioluminescent Reporter for DNA Hybridization Juuli 2002
- ↑ "Gaussia Luciferase". Originaali arhiivikoopia seisuga 9. november 2014. Vaadatud 1. novembril 2014.
- ↑ T. Rathnayaka, M. Tawa, S. Sohya, M. Yohda, Y. Kuroda Biophysical characterization of highly active recombinant Gaussia luciferase expressed in Escherichia coli September 2010
- ↑ "Gaussia Luciferase". Originaali arhiivikoopia seisuga 1. november 2014. Vaadatud 1. novembril 2014.
- ↑ http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bi011651q | Members of a Dinoflagellate Luciferase Gene Family Differ in Synonymous Substitution Rates | O. K. Okamoto, L. Liu, D. L. Robertson, J. Woodland Hastings | November 2001
- ↑ 12,0 12,1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15665092 | Crystal structure of a pH-regulated luciferase catalyzing the bioluminescent oxidation of an open tetrapyrrole | Schultz LW1, Liu L, Cegielski M, Hastings JW. | Jaanuar 2005
- ↑ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC547824/ | Crystal structure of a pH-regulated luciferase catalyzing the bioluminescent oxidation of an open tetrapyrrole | L. Wayne Schultz, L. Liu, M. Cegielski, J. Woodland Hastings | Jaanuar 2005
- ↑ Nakamura M1, Maki S, Amano Y, Ohkita Y, Niwa K, Hirano T, Ohmiya Y, Niwa H. Firefly luciferase exhibits bimodal action depending on the luciferin chirality Juuni 2005
- ↑ Lembert N. Firefly luciferase can use L-luciferin to produce light Juuli 1996
- ↑ Williams TM1, Burlein JE, Ogden S, Kricka LJ, Kant JA Advantages of firefly luciferase as a reporter gene: application to the interleukin-2 gene promoter Jaanuar 1989
- ↑ C. H. Contag, M. H. Bachmann Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression August 2002
- ↑ Antony Evans Glowing Plants: Natural Lighting with no Electricity